Protocole mynox

Pour des raisons à la fois économique et biologique, il est important d'éliminer les mycoplasmes des cultures cellulaires utilisées en recherche, diagnostic, et production biotechnologique. La méthode la plus communément utilisée pour l’élimination, l'inactivation ou la suppression des mycoplasmes dans les cultures cellulaires est le traitement aux antibiotiques. En général, les thérapies aux antibiotiques n'assurent pas une élimination durable des mycoplasmes. De plus, les propriétés cytotoxiques des antibiotiques peuvent avoir des effets secondaires sur les cellules eucaryotes et peuvent favoriser le développement de souches de mycoplasmes résistantes. Le Mynox^® présente de nombreuses caractéristiques exceptionnelles en comparaison aux autres méthodes et produits utilisés pour l'élimination des mycoplasmes.

-Mynox® est le premier réactif biologique qui élimine les mycoplasmes en les tuant.

-Mynox® a prouvé son efficacité en un seul traitement.

-L'activité du Mynox® est basée sur ses propriétés biophysiques, rendant le développement des souches résistantes hautement improbable.

-Mynox® s'élimine facilement après traitement.

Contrairement aux cellules mammifères, les mycoplasmes ne sont pas dotés de membranes cellulaires mais sont simplement encerclés par une membrane cytoplasmique. Le Mynox^® est un agent biologique qui s'intègre dans la membrane des mycoplasmes et agit sur son intégrité. Il en résulte un flux osmotique qui conduit à la complète désintégration de la membrane des mycoplasmes. Avec l'éradication des mycoplasmes, les cellules mammifères retrouvent immédiatement leur morphologie originelle et un taux de prolifération normal. Jusqu'à aujourd'hui, il n'a été démontré aucune variation des caractéristiques des cellules ayant été traitées par le Mynox^®.

Mynox® est utilisé pour l'élimination des Mycoplasmes et Acholeplasmes dans les cultures cellulaires et virales, et autres cultures biologiques.

Mynox® doit être utilisé pour la recherche uniquement.

3 Echantillon

3.1 Importance de la concentration du sérum

L'activité "antimycoplasmel" de Mynox^® est affectée par la concentration en lipides et protéines dans le mélange de réaction, par exemple la composition en supplément de sérum de veau fœtal. Ces ingrédients fixent de façon compétitive le Mynox^® et empêchent sa fixation sur la membrane des mycoplasmes. Par conséquent, le protocole d'élimination des mycoplasmes en cultures cellulaires a été conçu pour un milieu de culture spécifique standard, par exemple Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM) ou RPMI1640. Pour le traitement des lignées cellulaires, le protocole préconise un supplément de 5% v/v de sérum de veau fœtal. Pour les stocks de virus, il est recommandé que le milieu soit quasiment sans supplément de sérum pendant le traitement.

3.2 Les limites du Mynox^®

Mynox^® n'éliminera pas le "Mycoplasme penetrans " pénétrant dans les cellules.

Du fait de l'effet atténué du sérum, il est impossible de concevoir un protocole spécifique qui serait applicable pour le traitement de produits biologiques avec de grandes concentrations de protéines et de lipides.

Parce que l'effet biophysique du Mynox® est directement lié à son association avec la membrane des mycoplasmes, le réactif doit être en contact direct avec les mycoplasmes pour être efficace. Le traitement sur des cellules agrégées doit donc être évité. Les mycoplasmes sont protégés dans les espaces intercellulaires aussi bien que dans des poches et des fissures de la membrane cellulaire, ce qui peut empêcher le contact avec le produit. Nous suggérons d'utiliser de la trypsine pour détacher les cellules entre elles et pour lisser la surface des cellules.

3.3 Cytotoxicité du Mynox^®

Tout comme les autres produits disponibles sur le marché pour l'inactivation des mycoplasmes, Mynox^® présente aussi une cytotoxicité sur les cellules adhérentes et non adhérentes. Notre protocole a été testé sur plusieurs lignées cellulaires et a montré une cytotoxicité entre 10% et 80%, laissant assez de cellules viables pour les sous-cultures. Généralement, les taux de prolifération plus important liés à l'élimination du parasite compensent la perte des cellules pendant le traitement.

4 Protocole

Ces protocoles ont été mis au point pour des lignées cellulaires typiques nécessitant des milieux de culture standards. Minerva Biolabs ne garantit pas que ces protocoles seront efficaces dans toutes les situations. La modification de ces protocoles peut être nécessaire dans certain cas.

4.1 Traitement pour des lignées cellulaires adhérentes

4.1.1 Préparation des cellules et mélange d’élimination

Dans une boite de pétri stérile de diamètre 6 cm, mélanger :

ü 2,8 ml de milieu de culture cellulaire standard avec 5% de sérum de veau fœtal v/v

ü 200 µl de Mynox^®

ü Transférer 2 ml de 1x10⁴ à 1x10⁵ cellules fraîchement trypsinisées dans le milieu de culture cellulaire avec du sérum de Veau Fœtal (SVF) à 5% v/v.

ü Le volume total du traitement est de 5 ml.

Important :

- S’assurer que le traitement fonctionne sur un échantillon de cellules (vérifier sous microscope). Si nécessaire, augmenter le temps de traitement à la trypsine ou détacher les cellules les unes des autres par pipetage allez-retour.

- S'assurer que le Mynox^® est au préalable présent dans le milieu de culture avant d'y ajouter les cellules. Ajouter les cellules directement dans le milieu d’élimination pour éviter l’évaporation.

4.1.2 Traitement et élimination du Mynox^®

Après 2 heures d'incubation dans des conditions normales de culture, enlever la solution en éliminant le surnageant, puis recouvrir les cellules par du milieu de culture standard.

Pour une meilleure efficacité, maintenir les cellules en présence de Mynox^® pendant un passage entier (3 à 8 jours) dans des conditions de croissance normales. Puis éliminer la solution contenant le Mynox^® et cultiver les cellules dans du milieu de culture standard.

Important :

Durant le traitement, il est important de vérifier fréquemment les effets cytotoxiques sur la culture cellulaire et, si ces effets sont clairement observables, il faut arrêter immédiatement la réaction en changeant le milieu ou en diluant par 5 le mélange avec du milieu.

4.2 Traitement des cellules en suspension

4.2.1 Préparation des cellules et du mélange d’élimination

Mélanger dans un tube à centrifugation stérile :

ü 1.6 ml de mélange de trypsine à 0.125% et de 5mM d’EDTA dans tampon phosphate salin (PBS)

ü 200 µl de Mynox^®

ü transférer 1.6 ml de milieu de culture cellulaire standard avec 10% v/v de SVF et1x10⁴ à 1x10⁵ cellules d'une suspension de lignée cellulaire dans le mélange

ü Le volume total du mélange de traitement est de 3,4ml.

Important :

S’assurer que le traitement fonctionne sur un échantillon de cellules (vérifier sous microscope).

S'assurer que le Mynox^® est au préalable présent dans le milieu de culture avant d'y ajouter les cellules. Ajouter les cellules directement dans le milieu d’élimination pour éviter l’évaporation.

S'assurer que la solution d'élimination recouvre complètement la surface interne du tube à centrifuger.

L'usage de trypsine est nécessaire pour éviter que les cellules ne s'agrègent. Si la séparation des cellules peut être réalisée par d’autres techniques, remplacer le volume de trypsine par du milieu de culture cellulaire avant de mettre les cellules en contact avec le mélange d’élimination. Dans tous les cas, le volume total du mélange d’élimination doit être de 3,4 ml, si nécessaire, ajouter du PBS.

4.2.2 Traitement et élimination du Mynox^®

Mélanger doucement la solution à température ambiante pendant 30 minutes.

Centrifuger le tout (600 x g, 5 min) et éliminer le surnageant.

Resuspendre les cellules dans du milieu de culture cellulaire sans Mynox^®.

Pour plus d'efficacité, une sous-culture en présence de Mynox^® est possible pendant 1 passage: Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu de culture contenant 5% v/v de SVF et 150 µl de Mynox^®. Incuber les cellules dans ce milieu pendant 3 jours dans des conditions normales de culture, séparer les cellules du milieu par centrifugation, puis cultiver à nouveau les cellules dans du milieu sans Mynox^®.

Important :

4.3 Traitement des virus non enveloppés

4.3.1 Préparation des cellules et du milieu

Des aliquotes congelées ou non de cellules ainsi que des suspensions de virus sans débris cellulaires peuvent être traités. La concentration en virus n'a pas d'influence sur la réussite du traitement.

Mélanger dans un tube à essai stérile de 1.5 ml avec fermeture sécurisée les composés suivants:

ü 125 µl de solution de virus, contenant plus de 8% de SVF

ü 1 ml de milieu de culture sans SVF

ü 100 µl de Mynox^®

ü Le volume total du traitement est de 1,225ml.

Important : S'assurer que la solution d'élimination recouvre complètement la surface interne du tube à essai.

4.3.2 Traitement et élimination du Mynox®

Incuber la solution à température ambiante en agitant doucement pendant 2 heures.

La réaction est stoppée en diluant le Mynox^®à 1/10 dans le milieu de culture. Cette étape peut être bénéfique en utilisant la solution de réaction pour infecter un sous-confluent, culture de cellule hôte pour une propagation simultanée de la culture de virus sans mycoplasmes. Le volume final doit être 10 fois supérieur au volume de la solution de réaction.

Important : Tester la présence de mycoplasmes sur les lignées de cellules hôtes avant l'infection.

4.4 Traitement des virus enveloppés

La composition de la membrane externe de lipides des virus enveloppés est comparable à celle de la membrane des mycoplasmes, cible du Mynox^®. Ces virus sont également vulnérables à l'action du Mynox^®, en fonction du temps de traitement et de la concentration utilisés. Pour arriver à des suspensions de virus sans mycoplasmes après traitement avec un nombre de virus acceptable, la concentration initiale en virus doit être supérieure 10⁶ TCID₅₀.

4.4.1 Préparation des cellules et de la solution de réaction

Des aliquotes congelées ou non de cellules ainsi que des suspensions de virus sans débris cellulaires peuvent être traités.

Mélanger dans un tube à essai stérile de 15 ml avec bouchon à vis les composés suivants:

ü 0.5 ml de solution de virus, contenant plus de 8% de SVF

ü 4.4 ml de milieu de culture sans SVF

ü 100 µl de Mynox^®

ü le volume total du traitement est de 5ml.

Important : S'assurer que la solution d'élimination recouvre complètement la surface interne du tube.

4.4.2 Traitement et élimination du Mynox^®

Incuber la solution à température ambiante en agitant doucement pendant 2 heures.

La réaction est stoppée en diluant le Mynox^® à 1/10 dans le milieu de culture. Cette étape peut être bénéfique en utilisant la solution de réaction pour infecter un sous-confluent, culture de cellule hôte pour une propagation simultanée de la culture de virus sans mycoplasmes. Le volume final doit être 10 fois supérieur au volume de la solution de réaction.

Important :

- Tester la présence de mycoplasmes sur les lignées de cellules hôtes avant l'infection.

- Ces procédures d'élimination des mycoplasmes peuvent être répétées avec des virus directement prélevés de culture de cellules hôtes pour s'assurer que tous les mycoplasmes ont été éliminés.

4.5 Traitement des autres produits biologiques

Pour les échantillons à faibles concentrations en protéines et lipides, nous recommandons d'appliquer Mynox^® à une dilution de 1/50. Mais compte tenu de la diversité des produits biologiques, nous ne pouvons donner que des recommandations générales pour les applications du Mynox^®. Le protocole le plus approprié doit être optimisé pour chaque cas individuel.

5 Tester la présence de mycoplasmes

Pour une détection plus sensible de la contamination par mycoplasmes, nous recommandons le kit PCR de détection des mycoplasmes VenorGeM^® {Cat. N° 11-1025(VGM-025), 11-1050(VGM-050), 11-1100(VGM-100), 11-1250(VGM-250)}.

Important :

Les cultures cellulaires et souches de virus traitées par le Mynox^®doivent être cultivées sans antibiotiques pendant 3 passages, puis la présence ou non de mycoplasmes doit être testée afin de valider la réussite de traitement.

6 Appendice

Limite de garantie

Cette garantie limite notre responsabilité au remplacement de ce produit. Aucune garantie d'aucune sorte, explicite ou implicite, incluant, sans limitation, garanties implicites de commercialisation ou d'aptitude pour une application particulière, ne sont fournies. Minerva Biolabs ne sera pas tenu responsable d'éventuels dommages causés de façon directe, indirecte, conséquemment, ou survenus incidemment pendant l'usage, suite aux résultats, ou à l'impossibilité d'utiliser ce produit.

Note à l’acheteur : licence limitée.

Le prix d’achat de ce produit inclut une licence limitée, non transmissible, sous le brevet allemand N°19521938 ou ses doubles étrangers, propriété de Minerva Biolabs GmbH pour l’usage du produit en application de la technique Mynox. Aucun droit de réaliser ou d’offrir des services commerciaux de quelque sorte en utilisant Mynox est implicite ou explicite. Toute information sur l’achat de licence peut être obtenue en contactant Minerva Biolabs GmbH.

§ Le procédé Polymerase Chain Reaction§ (PCR^®) est couvert par des brevets propriétés de Hoffmann-La Roche. L’utilisation du procédé PCR^® nécessite une licence.

Schéma du protocole concernant le traitement des cellules adhérentes

protocole 02/04

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