Nouveau protocole optimisé disponible en ligne

Septembre 2007

                Septembre 2009 :  Version Venor Gem Advance prête à l'emploi! enfin disponible !!!!!

Table des matières

1.    Réactifs et matériels

1.1.       Contenu du kit

1.2.       Stabilité et stockage

1.3.       Equipement nécessaire

2.    Application et principe du test

3.    Protocole du test

3.1.       Préparation des échantillons

3.2.       Réhydratation des réactifs

3.3.       Profil thermique

3.4.       PCR Mastermix

3.5.       Migration sur gel d’agarose

3.6.       Evaluation du gel

4.    Appendice

 1.      Réactifs et matériels

1.1.   Contenu du kit

-Ensemble de primers et de                                                   REAC B                    bouchon rouge

désoxynucléotides triphosphates                                             

dATP, dCTP, dGTP et dUTP, lyophilisés,                  .

aliquotés pour 25 réactions (kit d’essai 5 réactions).

-Tampon de réaction, stérile 10X                                        REAC A                    bouchon bleu

500 µl

- ADN contrôle positif                                                         CONTROLE  +        bouchon vert

Fragment d'ADN lyophilisé du génome de

"Mycoplasma Orale" préparé par PCR (non infectieux)

- ADN contrôle interne                                                        CONTROLE  i          bouchon jaune

ADN plasmidique lyophilisé, non infectieux.

-Eau qualité PCR                                                                 REAC C                    bouchon blanc

Eau désionisée, exempte d’ADN pour la

ré-hydratation des composés lyophilisés et les réactions de PCR.

1.2.   Stabilité et stockage

Les composants des kits sont stables à température ambiante pendant le transport. Après réception, stocker entre 2°C et 8°C. Après réhydratation du mélange primers/nucléotides, de l’ADN contrôle positif, et de l’ADN contrôle interne, stocker à -18°C et limiter les étapes de congélation/décongélation. Pour réaliser des tests réguliers sur un petit nombre d’échantillons, les mélanges Primer/Nucléotides, le contrôle interne et le contrôle positif doivent être répartis en aliquots après réhydratation

En suivant ces recommandations, le kit est stable jusqu'à la date d'expiration inscrite sur le certificat de garantie (les certificats sont également disponibles sur le site www.minerva-biolabs.com).

1.3.   Equipement nécessaire

Thermocycleur pour PCR

Huile minérale pour certain type d'appareil PCR

Tubes pour les réactions d'amplification

Appareil d'électrophorèse sur gel d'agarose

Microcentrifugeuse

Micropipettes et pointes avec filtre

Polymérase

Note: Nous ne pouvons garantir ni une sensibilité optimale, ni une compatibilité avec les autres polymérases disponibles sur le marché. Si vous souhaitez tester notre MB Taq DNA Polymérase en parallèle avec votre propre polymérase, merci de prendre contact avec Biovalley : 0800 240 825 afin d’obtenir un échantillon gratuit (10 unités).

Cependant si vous souhaitez utiliser votre propre polymérase, il est alors nécessaire d’utiliser des tampons spécifiques fournis avec ces polymérases.

2.      Application et principe du test 

Venor^®GeM utilise la technique de "polymerase chain reaction" (PCR) qui est décrite comme une des méthodes les plus sensibles pour détecter des contaminations par des mycoplasmes et acholeplasmes dans les cultures cellulaires ou échantillons biologiques dérivés de ces cultures.

Haute sensibilité: La détection se fait pour d'aussi petites quantités que 1 à 5 fg d'ADN de mycoplasme, correspondant à la présence de 2 à 5 mycoplasmes par volume d’échantillon.

Large échelle de détection, haute spécificité: Le mélange de primers est spécifique au plus haut opéron d'ARNr conservé, ou plus spécifiquement, à la région codant pour l'ARNr 16S du génome du mycoplasme. Ceci permet de détecter les espèces de M.orale, M.hyorhinis, M. arginini, M. fermentans, M.salivarium, M.hominis, mycoplasmes rencontrées habituellement en tant que contaminants de cultures cellulaires ainsi que M.pneumoniae, Acholeplasma laidlawii, M.synoviae et Ureaplasma species. L'ADN eucaryote et bactérien n'est pas amplifié par Venor^®GeM.

Simplicité: Seulement un test est nécessaire pour détecter toutes les espèces de Mycoplasmes.

Résultats rapides: Les résultats peuvent être obtenus en moins de 3 heures.

Contrôle interne: VenorGeM est fourni dorénavant avec de l’ADN contrôle interne, qui peut être ajouté à la réaction PCR. La réaction PCR réalisée avec l’ADN contrôle interne donne une bande distincte à 191 bp sur  gel d’agarose.

3.      Protocole du test 

3.1.   Préparation des échantillons 

Les échantillons doivent être issus de cultures arrivées à 90-100% de confluence.

Des substances inhibitrices de PCR peuvent s’être accumulées dans les milieux des vieilles cultures. Pour ces échantillons, une extraction d’ADN avant le test est fortement recommandée.

La présence de pénicilline ou de streptomycine dans le milieu de culture n’inhibe pas les mycoplasmes ou n’affecte pas la sensibilité du test.

Ce test permet la détection des mycoplasmes dans le surnageant cellulaire. Les agrégats cellulaires ne doivent pas être testés car les débris cellulaires vont interférer avec la réaction de PCR.

Avec des concentrations moyennes de 10⁶ et une concentration maximale de 10⁸, il y a suffisamment de mycoplasmes dans le surnageant pour garantir la sensibilité du test.

Les agrégats cellulaires ainsi que le sérum de veau fœtal, vaccins et échantillons enrobés dans la paraffine doivent subir une extraction d’ADN préalablement au test de dépistage.

Les échantillons pour l'analyse PCR sont préparés en chauffant le surnageant des cultures cellulaires ou autres cultures biologiques pendant 5 minutes de la façon suivante :

            1-Transférer 100 µl de surnageant de la culture à tester dans un microtube à centrifuger stérile. Bien fermer le tube pour éviter qu'il ne s'ouvre pendant la phase de chauffage. Nous recommandons les tubes de micro centrifugation avec des fermetures sécurisées.

            2-Faire bouillir ou incuber l'échantillon de surnageant à 95°C pendant 5 minutes.

            3-Centrifuger brièvement (5 secondes) l'échantillon pour agréger les débris cellulaires avant de l'ajouter aux réactifs de PCR.

3.2.   Réhydratation des réactifs 

1-Centrifuger les tubes avec les composants lyophilisés (5 secondes à vitesse maximale)

2-Ajouter une quantité appropriée d’eau désionisée exempte d’ADN (bouchon blanc):

Primer / Mélange de nucléotides (pour 25 réactions)………….       65 µL

Kit d’essai: Primer / Mélange de nucléotides (pour 5 réactions)      15 µL

ADN Contrôle positif …………………………………............     300 µL

ADN Contrôle interne …………………………………………    300 µL

3-Incuber pendant 5 minutes à température ambiante

4-Agiter et centrifuger à nouveau.

3.3.   Profil thermique 

Le processus de programmation du thermocycleur est expliqué dans le manuel de l’instrument.

Programme :

Le temps d’incubation dépend de la polymérase utilisée. Certaines enzymes « Hot Start » ont besoin d’être activées à 94°C pendant plus de 2 minutes.

Veuillez consulter la fiche technique de la polymérase pour la durée d’incubation.

3.4.   PCR Mastermix

Le volume total par réaction est de 25 µL. Lors de la préparation des réactions, il faut prendre en compte dans les calculs les contrôles positifs et négatifs.

Sur la glace, prélever le mélange et verser dans un tube de 1,5 mL.

Mélanger doucement.

Combinaison de pipetage

*équivalent au contenu d’un flacon au bouchon rouge.

Pour les autres concentrations de polymérase, la quantité d’eau nécessaire doit être ajustée.

Pour les contrôles, ajouter 2µl de l’ADN du contrôle positif et 2µl d’eau (bouchon blanc) pour le contrôle négatif.

Ajouter 2 µl d’échantillon (comme décrit au-dessus) dans le tube de réaction PCR par échantillon à tester. Après le prélèvement du contrôle négatif, le tube doit être bouché avant d’utiliser les échantillons. Le prélèvement des échantillons et la fermeture des tubes doivent être finis avant d’introduire le contrôle positif (bouchon vert) afin d’éviter les contaminations croisées.

3.5.   Migration sur gel d’agarose 

- Gel d’agarose standard à 1.5% d’environ 5mm d’épaisseur avec un peigne de 5mm.

- Déposer dans les puits de chaque ligne 5 µL d’échantillon de PCR, mélangés à du tampon de charge « bleu de bromophénol ».

Utiliser uniquement du bleu de bromophénol à de faibles concentrations comme marqueur de migration.

- Arrêter l’électrophorèse lorsque la distance de migration a atteint 2 cm (cela dépend de la chambre d’électrophorèse utilisée – par exemple, migration pendant 20 minutes à 100V).

3.6.   Evaluation du gel 

Si on utilise l’ADN contrôle interne, une bande distincte de 191 pb doit apparaître sur toutes les lignes indiquant la réussite de la PCR. Il se peut que cette bande perde de l’intensité avec les quantités croissantes d’amplicons formés, causé par des concentrations d’ADN de mycoplasme >5x10⁶ copies/ml.

La concentration initiale de l’ADN contrôle positif  est supérieure à 5x10⁶ copies/ml afin de prendre en compte la perte d’ADN résultant de congélations et décongélations répétées.

Taille des amplicons

Résultats obtenus avec une PCR réussie

La non amplification de l’ADN de contrôle peut être due aux raisons suivantes :

-         L’activité de la Taq polymérase est insuffisante

-         Les tubes de l’ADN de contrôle n’ont pas été centrifugés avant la réhydratation.

-         Erreur de programmation

-         Erreur de pipetage des échantillons

Avant de répéter la manipulation avec le contrôle positif et négatif, veuillez consulter le protocole du thermocycleur et les combinaisons de pipetage.

Lors de l’utilisation d’autres polymérases que la polymérase MB TAQ DNA de Minerva-Biolabs, veuillez vous référer aux commentaires faits au chapitre 1.3.

La concentration peut alors être augmentée à 2.5 U/réaction.

Veuillez noter les changements complets de combinaison de pipetage.  

Interprétation de modèles de bandes possibles

Avec Venor^®GeM conçu pour sa haute sensibilité et par conséquent prédisposé à des hybridations non spécifiques, des bandes de longueur variable moins intenses peuvent être produites mais n’indiquent pas un résultat positif. Il est possible que les primers auto hybridés produisent d’autres bandes de 80-90 pb de longueur, mais n’affectent pas la précision ou le résultat du test.

Si la PCR est inhibée, les inhibiteurs peuvent facilement être retirés de l’échantillon par extraction d’ADN à l’aide d’un kit adapté du commerce.

100 bp DNA Ladder

contrôle négatif

contrôle positif

échantillon inhibé

échantillon négatif

échantillon positif, faible contamination

échantillon positif, forte contamination

Schéma du protocole pour la détection de Mycoplasmes dans les surnageants cellulaires

4.      Appendice

Mycoplasmes détectés et taille des Amplicons:

No.                  Espèces                                 Taille de l’Amplicon (pb)

1               Mycoplasma orale^1,2                                 266

2               Mycoplasma pneumoniae²                        273

3               Mycoplasma penetrans                             274

4               Mycoplasma pirum                                   274

5               Acholeplasma laidlawii²                                    273

6               Mycoplasma fermentans                           267

7               Ureaplasma urealyticum                           273

8               Mycoplasma hyorhinis²                             268

9               Mycoplasma pulmonis                              268

10             Mycoplasma falconis                                268

11             Mycoplasma arthritidis                             267

12             Mycoplasma arginini                                267

13             Mycoplasma spermatophilum                   267

14             Mycoplasma opalescens                           266

15             Mycoplasma primatum                             267

16             Mycoplasma maculosum                          267

17             Mycoplasma bovis                                    267

18             Mycoplasma cloacale                                266

19             Mycoplasma hyosynoviae                         265

20             Mycoplasma synoviae²                             266

21             Mycoplasma salivarium                            266

22             Mycoplasma faucium                                265

23             Mycoplasma hominis                                266

24             Mycoplasma genitalium                            273

25             Mycoplasma bovigenitalium                     267

26             Mycoplasma sp. ovine/caprine                 267

27             Mycoplasma agalactica                            267

28             Mycoplasma timone                                  266

¹ Fourni pour l’ADN du contrôle positif

² Souches test de mycoplasme selon la pharmacopée européenne, Suppl. 2000, 2.6.7. Mycoplasmas.

Limite de garantie

Cette garantie limite notre responsabilité au remplacement de ce produit. Aucune garantie d'aucune sorte, explicite ou implicite, incluant, sans limitation, garanties implicites de commercialisation ou d'aptitude pour une application particulière, ne sont fournies. Minerva Biolabs ne sera pas tenu responsable d'éventuels dommages causés de façon directe, indirecte, conséquemment, ou survenus incidemment pendant l'usage, suite aux résultats, ou à l'impossibilité d'utiliser ce produit.

Notes à l’acheteur

Ce produit est optimisé pour une utilisation dans la  Polymerase Chain Reaction^§ (« PCR ») breveté par Hoffmann-La Roche, Inc et F.Hoffmann-La Roche Ltd, (« Roche »). Aucune licence sur ces brevets pour l’utilisation du procédé PCR n’est transmise expressément ou implicitement à l’utilisateur de ce produit. Minerva Biolabs n’encourage pas ou ne soutient pas l’utilisation non autorisée ou non licenciée du procédé PCR. L’utilisation de ce produit est recommandée aux personnes qui ont une licence pour réaliser des PCR ou ne nécessitent pas l’obtention d’une telle licence.

^§ Le procédé Polymerase Chain Reaction (« PCR ») est couvert par des brevets propriétés de Hoffmann-La Roche (« Roche »). L’utilisation du procédé PCR nécessite une licence.

Marque déposée :

Venor, Onar, Mynox et Mycoplasma Off sont des marques déposées par Minerva Biolabs GmbH, Allemagne.

Références des produits :

Demandez le catalogue MinervaBiolabs 2010

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