Pour tous les appareils à RT-PCR courants

excepté ABI7000, 7700, 7900

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Table des Matières

1. Réactifs et Matériels

1.1. Contenu du kit

1.2. Stabilité et Stockage

1.3. Equipement supplémentaire

2. Application et principe du test

2.1. Spécificité

2.2. Sensibilité

3. Protocole du test

3.1. Préparation des échantillons

3.2. Réhydratation des réactifs

3.3. Protocoles Expérimentaux

3.3.1. LightCycler® I / II

3.3.2. Autres Appareils à PCR en Temps Réel

3.4. Le mélange PCR (Mastermix)

3.5. Evaluation du test

3.5.1. Analyse des données obtenues avec un LightCycler® II

3.5.2. Courbes typiques d’amplification

Appendice

Références des produits

1.      Réactifs et Matériels :

1.1   Contenu du kit :

  Manuel d’instruction                                                                                       1 unité

            A) Primer/ Sonde/ mélange de nucléotides Mycoplasma spp.                      Bouchon rouge

Ensemble de primer, sondes et désoxynucléotides                                           REAC  B

triphosphates lyophilisés : dATP, dCTP, dGTP,

et dUTP, en aliquots pour 25 réactions                                                          

            B) Primer/ Sonde/ mélange de nucléotides Mycoplasma pneumoniae         Bouchon blanc

Ensemble de primer, sondes et désoxynucléotides                                           REAC  B

triphosphates lyophilisés : dATP, dCTP, dGTP,

et dUTP, en aliquots pour 25 réactions                                                          

            C) Primer/ Sonde/ mélange de nucléotides Acholeplasma laidlamii            Bouchon noir

Ensemble de primer, sondes et désoxynucléotides                                           REAC  B

triphosphates lyophilisés : dATP, dCTP, dGTP,

et dUTP, en aliquots pour 25 réactions                                                          

Sonde de contrôle interne                                                                             Bouchon orange

            Sonde lyophilisée, en aliquots pour 75 réactions                                              REAC  C                       

            Tampon de réaction PCR 10x                                                                      Bouchon bleu

500µL                                                                                                            REAC 

ADN Contrôle positif                                                                                    Bouchon vert

      Fragments d’ADN de Mycoplasma orale,                                                         CONTROL   +

      A. laidlawii et M. pneumoniae préparés par PCR,

non infectieux, lyophilisés.

ADN Contrôle interne                                                                                   Bouchon jaune

ADN plasmidique, lyophilisé, non-infectieux                                                    CONTROL   i

Eau de qualité PCR                                                                                        Bouchon blanc

Eau pour solubiliser les composés et pour les Mastermixs                                    REAC  H

1.2  Stabilité et Stockage 

Les composants du kit sont stables pendant l’expédition. Après réception du kit, récupérer et placer la Taq DNA Polymérase à -20°C. Conserver le reste des composés du kit entre +2°C et +8°C. Après réhydratation des mélanges Primer/Sonde/Nucléotides, de la sonde de contrôle interne, du contrôle positif et du contrôle interne, stocker à -18°C et éviter les étapes répétées de congélation/décongélation.

Pour réaliser des tests réguliers sur un petit nombre d’échantillons, les mélanges Primer/Sonde/Nucléotides, la sonde de contrôle interne et les contrôles doivent être répartis en aliquots après réhydratation.

En suivant ces recommandations, le kit est stable jusqu’à la date d’expiration inscrite sur le certificat de garantie (les certificats sont également disponibles sur le site www.minerva-biolabs.com).

1.3  Equipement supplémentaire :

·        Thermocycleur pour PCR en temps réel,

·        Capillaires en verre ou tubes pour réactions PCR.

·        Microcentrifugeuses, micropipettes et pointes avec filtres.

2.      Application et principe du test : 

Venor^®GeM-qEP utilise la "polymerase chain reaction" (PCR), qui est décrite comme la méthode de choix de haute sensibilité dans la détection des contaminations par Mycoplasmes dans les cultures cellulaires et échantillons biologiques dérivés de ces cultures. Le kit a été validé en accord avec la « Pharmacopée Européenne ». Il inclut 3 mélanges différents de Primer/Sonde/Nucléotides. Ces mélanges contiennent les sondes Scorpion marquées FAM spécifiques de différents Mycoplasmes.  Le mélange Mycoplasma spp. détecte une large gamme de Mycoplasmes (voir la liste détaillée), le mélange Primer/Sonde/Nucléotides M. pneumoniae détecte Mycoplasma pneumoniae et le troisième mélange est spécifique de Acholeplasma laidlawii.

Venor^®GeM-qEP fournit également un contrôle interne, qui peut être ajouté à la réaction. Lorsque que la réaction PCR est effectuée avec le contrôle interne, le succès de la réaction est indiqué par un signal fluorescent distinct. Ce signal peut être réduit ou absent avec des échantillons hautement contaminés par des Mycoplasmes. S’il n’y a aucun signal pour l’amplification « Mycoplasmes » ni pour l’amplification du contrôle interne, l’échantillon biologique doit avoir inhibé la PCR et une extraction d’ADN doit être faite.

L’Uracil-DNA Glycosylase (UNG) sensible à la chaleur est utilisable pour empêcher les contaminations croisées entre les PCR. Cette technique consiste en l’incorporation de désoxyuridine triphosphate (dUTP) pendant toutes les réactions d’amplification et le prétraitement de tous les mélanges successifs PCR avec l’UNG sensible à la chaleur. UNG clive l’ADN  sur les sites où un résidu désoxyuridylate a été incorporé.

Par la suite, les sites résultants sont hydrolysés par l’augmentation de la température pendant l’étape de dénaturation initiale, et ne peuvent plus servir de modèle de PCR, quelle que soit la longueur. L’UNG sensible à la chaleur est inactivé en même temps

L’ADN natif (l’ADN de l’échantillon) ne contient pas d’Uracile et de ce fait n’est pas dégradé par cette procédure.

UNG n’est pas fourni avec ce kit Venor^®GeM-qEP.

2.1 Spécificité

La détection croisée de bactéries ayant une relation phylogénique proche des Mycoplasmes n’est pas contrôlée. La « Pharmacopée Européenne » recommande d’analyser les ADN de Clostridium, Lactobacillus et Streptococcus. Aucune des espèces suivantes n’est détectées avec le kit de détection Venor^®GeM-qEP : Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus acidophilus et Streptococcus pneumoniae. De plus il n’y a aucun signal positif avec l’ADN humain, murin et bactérien (par exemple : Legionella sp., Chlamydophila sp., Bordetella sp.) en tant qu’étalon.

Liste des mycoplasmes détectés par le kit Venor^®GeM-qEP :

 *Détection avec respectivement les mélanges Primer/Sonde/Nucléotides Acholeplasma laidlawii et Primer/Sonde/Nucléotides Mycoplasma pneumoniae.

 2.2 Sensibilité

Le seuil de sensibilité positif (copies de génome/PCR) a été déterminé pour les 3 mélanges Primer/Sonde/Nucléotides en utilisant différentes espèces de Mycoplasmes comme étalon : Mycoplasma spp. PCR : 12,5 (pour M. fermentans, M. hyorhinis, M. orale, M. arginini), A. laidlawii PCR : 8 (pour A. laidlawii) ; M. pneumoniae PCR : 50 (pour M. pneumoniae).

3.      Protocole du test 

3.1  Préparation des échantillons :

Les échantillons doivent être issus de cultures arrivées à 90-100% de confluence. Des substances inhibitrices de PCR peuvent s’être accumulées dans les milieux des vieilles cultures. Pour ces échantillons, une extraction d’ADN avant le test est fortement recommandée. La Pénicilline et la Streptomycine dans le milieu de culture n’inhibent pas les Mycoplasmes ou n’affecte pas la sensibilité du kit. Seul le surnageant des cultures cellulaires doit être utilisé pour le test de détection des mycoplasmes. Les agrégats cellulaires ne doivent pas être testés parce que les débris cellulaires vont interférer avec la réaction de PCR. Avec des concentrations moyennes de 10⁶ et une concentration maximale de 10⁸, il y a suffisamment de mycoplasmes dans le surnageant pour garantir la sensibilité du test.

Cependant, d’autres matériels peuvent être testés tels que sérum de veau fœtal, vaccins et échantillons enrobés dans la paraffine, ayant préalablement subis une extraction d’ADN.

Si nécessaire, les échantillons pour analyse PCR peuvent être préparés par extraction d’ADN en utilisant des kits d’extraction commerciaux (par exemple : QIAamp, Blood Kit, Qiagen). S’assurer de bien éliminer les tampons de lavage contenant de l’alcool des préparations afin d’éviter une co-élution d’alcool et d’échantillon. En effet, toute trace d’alcool peut inhiber la PCR. 2 µl d’extrait peuvent être directement utilisé en tant qu’échantillon de PCR.

Pour éviter des résultats faux positifs, nous recommandons d'utiliser l'eau de qualité PCR fournie avec le kit, des pointes pour micropipettes avec filtres et des gants.

Les échantillons pour l'analyse PCR sont préparés en chauffant le surnageant des cultures cellulaires ou autres matériels biologiques de la façon suivante (voir ci-dessous). Cette procédure permet de lyser les Mycoplasmes et d’inactiver les DNAses.

1- Transférer 100 à 500 µl de surnageant de la culture à tester dans un micro tube à centrifuger stérile. Bien fermer le tube pour éviter qu'il ne s'ouvre pendant la phase de chauffage.

            2- Faire bouillir ou incuber le surnageant à 95°C pendant 10 minutes.

            3- Prélever 2 µl pour l’échantillon PCR; l’échantillon est stable jusqu’à 5 jours entre +2°C et +8°C ; placer l’échantillon à -20°C pour un stockage à long terme.

3.2  Réhydratation des réactifs :

1- Centrifuger les tubes avec les composants lyophilisés (5 secondes à vitesse maximale)

2-     Ajouter une quantité appropriée d’eau désionisée, exempte d’ADN :

Primer /Sonde /Mélange de nucléotides……… 65 µL

Sonde de Contrôle interne …………………….     195 µL

ADN Contrôle positif ........................................     300 µL

ADN Contrôle interne .......................................     300 µL

3-     Incuber pendant 10 minutes à température ambiante

4-     Agiter et centrifuger à nouveau.

3.3  Protocoles Expérimentaux :

3.3.1  LightCycler^® I / II

Programme 1 : Pré incubation

Programme 2 : Amplification

Programme 3 : Refroidissement

3.3.2  Autres Appareils à PCR en Temps Réel

        (ABI7500, ABI StepOne, SmartCycler^®, Stratagene-Cycler)

Désignation des détecteurs :

·             Sonde cible :                            Reporter- FAM                                  Quencher  - aucun

·             Sonde contrôle interne :           Reporter- ROX/Texas Red                 Quencher  - aucun

Programme :

*45 secondes pour ABI7500 et ABIStepOne

3.4  Le mélange PCR (Mastermix)

Le volume total par réaction est de 25 µL. Quand les réactions sont mises en place, il faut prendre en compte dans les calculs les contrôles positifs et négatifs.

Exemple de combinaison de pipetage

* (Bouchon rouge, ou blanc ou noir)

* (25 réactions équivalent au contenu complet d’un flacon au bouchon rouge, blanc ou noir)

Verser un aliquot de 23.0 µL du mélange « Mastermix » dans chaque tube de réaction PCR.

Ajouter 2.0 µL d’échantillon (comme décrit ci-dessus) dans un tube de réaction PCR par échantillon à tester.

Après le prélèvement du contrôle négatif (2.0 µL d’eau ou d’un contrôle révélé négatif après extraction d’ADN et réaction), le tube doit être bouché avant de manipuler les échantillons.
Le prélèvement des échantillons et la fermeture des tubes doivent également être effectués avant de manipuler le contrôle positif (2.0 µL/réaction) afin d’éviter les contaminations croisées.

3.5  Evaluation du test

L’analyse des données obtenues est divisée en deux parties :

·        L’analyse quantitative de l’ADN de Mycoplasme dans le canal fluorescence F1/530 nm ou signal spécifique FAM.

·        L’analyse qualitative de l’ADN de contrôle interne dans le canal fluorescence F2/610 nm ou signal spécifique ROX.

Pour des échantillons non contaminés par des mycoplasmes et faiblement contaminés, un signal du contrôle interne peut être vu à environ 29-35 Ct.

Une forte contamination par des mycoplasmes va provoquer une baisse ou une disparition du signal du contrôle interne; des échantillons inhibés ne présentent aucune amplification pour les signaux spécifiques FAM ou ROX.

3.5.1  Analyse des données obtenues avec un LightCycler^® II

Les signaux du contrôle interne sont faiblement visibles dans le canal 610 nm. Utiliser la procédure suivante pour une meilleure visibilité :

- Sélectionner le canal 610 nm (« Select channel 610 nm »)

- Sélectionner le canal dénominateur 530 nm (« select channel denominator 530 nm »)

- Cliquer une fois l’axe Y avec le bouton droit de la souris et choisir la bonne mise en forme pour changer l’échelle de l’axe.

- Désélectionner « Y-automatic » et compléter « 0-2 »

Ne pas oublier d’enregistrer vos modifications à la fin cette manipulation avec « safe ».

Résultats

Le contrôle négatif et les échantillons négatifs: Augmentation de la fluorescence entre le croisement du seuil 29-35.

Le contrôle positif et les échantillons positifs: Baisse de la fluorescence (seulement sur ce mode).

Echantillons inhibés: Aucune modification de fluorescence, la PCR est inhibée. Une extraction d’ADN est nécessaire, puis refaire le test de détection.

3.5.2  Courbes typiques d’amplification

Les courbes d’amplification suivantes ont été obtenues en suivant la procédure décrite avec une série de dilutions du Standard de quantification Mycoplasma fermentans (Cat no. 52-0112) et avec un LightCycler^®.

Les valeurs de fluorescence par rapport au nombre de cycles sont affichées.

                                                      Figure 1 :

Séries de dilutions amplifiées d’approximativement 2.5 10⁴, 2.5 10³, 2.5 10², 25 et 5 équivalents génomes de Mycoplasma fermentans utilisés en tant qu’étalons. Pour le contrôle négatif, l’échantillon d’ADN a été remplacé par de l’eau de qualité PCR. Le signal de fluorescence spécifique est détecté dans le canal F1.

Simultanément l’amplification de l’ADN contrôle interne est mesurée dans le canal F2.

                                                              Figure 2 :

ADN de contrôle interne ainsi qu’une série de dilutions amplifiées de Mycoplasma fermentans utilisés en tant qu’étalons. Pour le contrôle négatif, l’échantillon d’ADN a été remplacé par de l’eau de qualité PCR. Le signal de fluorescence spécifique est détecté dans le canal F2.

Une contamination par des mycoplasmes est indiquée par une augmentation du signal de fluorescence dans le canal FAM pendant la PCR.

La concentration du contaminant peut être calculée par un logiciel comparant de façon croisée le nombre de cycles de l’échantillon avec une courbe standard réalisée simultanément.

Une PCR réussie sans inhibition est indiquée par une augmentation de signal de fluorescence dans le canal ROX, à condition que le contrôle interne soit additionné au « Mastermix ».

L’ADN de mycoplasme et l’ADN du contrôle interne sont en compétition lors de la PCR.

Parce que  la concentration d’ADN de contrôle interne est très faible dans le mélange PCR, le signal dans le canal F2 est réduit avec des quantités d’ADN de mycoplasme > à 1000 copies/test dans les échantillons.

La non amplification d’ADN de contrôle peut être due aux raisons suivantes :

·        Les tubes d’ADN de contrôle n’ont pas été centrifugés avant la réhydratation

·        Le temps de solubilisation des composés lyophilisés a été trop court

·        Erreur de programmation

·        Erreur de pipetage

Avant de refaire une manipulation avec le contrôle positif et négatif, veuillez consulter le protocole du thermocycleur et les combinaisons de pipetage.

Appendice

Limite de garantie :

Cette garantie limite notre responsabilité au remplacement de ce produit. Aucune garantie d’aucune sorte, explicite ou implicite, incluant, sans limitation, garanties implicites de commercialisation ou d’aptitude pour une application particulière, ne sont fournies. Minerva-Biolabs ne sera pas tenu responsable d’éventuels dommages causés de façon directe, indirecte, conséquemment, ou survenus incidemment pendant l’usage, suite aux résultats, ou à l’impossibilité d’utiliser ce produit.

Note à l’acheteur :

Ce produit est optimisé pour une utilisation dans la « Polymerase Chain Reaction » (« PCR ») breveté par Hoffmann-La Roche, Inc., et F.Hoffmann-La Roche Ltd, (« Roche »). Aucune licence sur ces brevets pour l’utilisation du procédé PCR n’est transmise expressément ou implicitement à l’utilisateur de ce produit. Minerva-Biolabs n’encourage pas ou ne soutient pas l’utilisation non autorisée ou non licenciée du procédé PCR. L’utilisation de ce produit est recommandée aux personnes qui ont une licence pour réaliser des PCR  ou ne nécessitent pas l’obtention d’une telle licence.

Limite de licence :

L’utilisation de ce produit pour la détection de contamination par les Mycoplasmes est couverte par une licence Scorpions de DxS Ltd. Des informations supplémentaires sur les licences Scorpions peuvent être obtenues à l’adresse suivante DxS Ltd, 48 Grafton St, Manchester, UK M13 9XX.

Marques commerciales :

LightCycler est une marque déposée d’un membre du groupe Roche. ABI Prism est une marque déposée de Applera Corporation ou ses filiales au Etats-Unis et certains autres pays. Venor, Onar, Mynox et Mycoplasma Off sont des marques déposées de Minerva Biolabs.

Références des produits :

Kits de détection des Mycoplasmes pour PCR en temps réel

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