Coloration des cellules

                                        en Immunofluorescence :

1. Faire croître les cellules sur les µ-lames ibidi comme décrit dans le manuel. Laver rapidement avec du PBS et fixer les cellules en utilisant de l’acétone froid pendant 5 minutes.

2. Vider les réservoirs de la µ-lame ibidi. Les étapes suivantes peuvent être faites en utilisant uniquement un volume identique à celui du canal. Pour les étapes de lavage, nous vous recommandons d’utiliser deux fois 1mL de PBS.

3. Remplacer l’acétone en lavant le canal avec du PBS.

4. Incuber les cellules avec du sérum à 10% de PBS pendant 20 minutes. Ceci permet de supprimer les liaisons non spécifiques. Laver avec du PBS comme recommandé.

5. Incuber les cellules avec l’anticorps primaire pendant au moins 60 minutes. Grâce au petit volume du canal, vous n’avez besoin que de 100 µL de solution d’anticorps, qui doit être pipetée avec soin directement dans le canal. Laver avec du PBS comme recommandé.

6. Incuber ensuite pendant 40 minutes avec un fluorophore conjugué ou un anticorps secondaire biotinylé. Laver avec du PBS comme recommandé. Si vous utilisez un anticorps conjugué à un fluorophore, protégez la µ-lame ibidi de la lumière et continuez avec l’étape 8.

7. Incuber avec de la fluorescéine-streptavidine pendant 15 minutes et protéger la µ-lame  de la lumière. Laver 4 fois avec du PBS.

8. Monter la lame avec le milieu de fixation aqueux (voir la section suivante) ou 80 % de glycérol dans du PBS.

9. Analyser la fluorescence en utilisant un microscope avec des filtres appropriés. Conserver les µ-lames protégées de la lumière.

Montage hydrophile

Malgré le faible RI (indice de réfraction de 1,333), l’eau sert de milieu de montage temporaire convenant pour quelques spécimens entiers, pour l’examen de certains microorganismes vivants (montage salin) et particulièrement lors de la vérification des sections pendant les procédures de coloration.

Glycérol

Le Glycérol est utilisé temporairement mais avec un fort RI (1,460) et met plus de temps à sécher que l’eau. La fermeture des µ-lames avec un couvercle augmente la durée de vie des sections montées, bien que les colorants cationiques diffusent dans le milieu. Le tampon Glycérol Phosphate (RI 1,47) est communément utilisé pour monter les sections pour l’immunofluorescence et le glycérol peut être ajouté à d’autre agents pour retarder le séchage et le craquellement.

Réactifs

1.       0,2 mol/L tampon phosphate 2 parts

     2.      glycérol 8 parts

                                                             Demande de catalogue Ibidi 2010               

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