Les anticorps primaires anti-humains conjugués aux Alexa Fluor® sont des immunoréactifs fluorescents utilisant une famille de colorants synthétiques hautement photostables, brillants et insensibles au pH, permettant la détection d’antigènes humains sur plusieurs plages spectrales. Produits après immunisation d’hôtes tels que la chèvre, le lapin, la souris ou le rat avec des immunoglobulines humaines purifiées ou des protéines humaines spécifiques, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués de manière covalente à des colorants Alexa Fluor® par une chimie utilisant des esters de NHS ciblant les amines primaires. La gamme Alexa Fluor® couvre l’ensemble du spectre visible et du proche infrarouge, notamment Alexa Fluor® 488 (vert, ex/em 495/519 nm), 555 (orange, ex/em 555/565 nm), 594 (rouge-orangé, ex/em 590/617 nm), 647 (rouge lointain, ex/em 650/665 nm), 680 (proche infrarouge, ex/em 679/702 nm) et 790 (proche infrarouge, ex/em 792/803 nm). Ces colorants présentent des propriétés supérieures à celles des fluorophores traditionnels : une photostabilité exceptionnelle permettant des acquisitions prolongées, des rendements quantiques élevés (0,30–0,92 selon le variant), une fluorescence insensible au pH entre 4 et 10, ainsi qu’une excellente solubilité dans l’eau limitant les phénomènes d’agrégation. Les spécificités disponibles comprennent les anticorps anti-IgG humaine (H+L), anti-IgG humaine (Fc), des réactifs spécifiques des isotypes (IgG1–IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD), ainsi que des anticorps dirigés contre les marqueurs CD humains, les cytokines et les protéines de signalisation. Une adsorption croisée étendue permet d’éliminer les liaisons non spécifiques dans les échantillons contenant plusieurs espèces.
Applications
Les conjugués Alexa Fluor® sont utilisés dans de nombreuses plateformes reposant sur la fluorescence. En microscopie d’immunofluorescence et en imagerie confocale, leur photostabilité permet des acquisitions prolongées, la réalisation de séries en profondeur (z-stack) et l’utilisation de techniques de super-résolution telles que la STED, la PALM et la STORM. En cytométrie en flux et en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), leur forte intensité de fluorescence facilite la détection d’antigènes humains faiblement exprimés dans des panels multicolores, avec des besoins limités en compensation spectrale. Les autres applications comprennent le criblage à haut contenu, le Western blot fluorescent, l’immunohistochimie, les essais multiplex Luminex® et l’imagerie proche infrarouge in vivo. Les dilutions de travail varient généralement de 1:100 à 1:2 000 selon le variant du colorant et l’application. Ces conjugués doivent être conservés à 4°C et protégés de la lumière. Ils sont destinés exclusivement à la recherche et ne sont pas destinés aux procédures diagnostiques.
