Les anticorps primaires anti-humains conjugués à la fluorescéine sont des immunoréactifs fluorescents émettant dans le vert, utilisés pour la détection des antigènes humains dans diverses applications basées sur la fluorescence. Produits par immunisation d’espèces hôtes telles que la chèvre, le lapin, la souris ou le rat avec des immunoglobulines humaines purifiées ou des protéines humaines spécifiques, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués à la fluorescéine, un colorant xanthène de faible poids moléculaire dont les maxima d’excitation et d’émission se situent respectivement à environ 494 et 521 nm. La fluorescéine présente un coefficient d’extinction molaire élevé (~76 000 M−1cm−1) et un rendement quantique élevé (~0,92), contribuant à son utilisation étendue dans les tests basés sur la fluorescence.
Contrairement à la FITC (isothiocyanate de fluorescéine), le dérivé isothiocyanate le plus couramment utilisé pour le marquage, le terme « fluorescéine conjuguée » désigne souvent des anticorps conjugués à la FITC, la FITC constituant la forme réactive qui forme des liaisons covalentes avec les amines primaires des résidus de lysine. Le processus de conjugaison permet généralement d’obtenir des rapports fluorophore/protéine (F/P) compris entre 3 et 8, afin d’optimiser l’intensité de fluorescence tout en préservant l’affinité de liaison à l’antigène. Les spécificités disponibles comprennent les anticorps anti-IgG humaine (H+L), anti-IgG humaine (Fc), les réactifs spécifiques d’isotypes (IgG1–IgG4, IgA, IgM, IgE), ainsi que les anticorps dirigés contre les marqueurs CD humains (CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD45, etc.), les cytokines et les protéines de signalisation. Une adsorption croisée étendue contre les protéines sériques d’origine murine, rat, lapine et bovine permet de réduire les liaisons non spécifiques dans les échantillons multispécifiques.
Applications
Les conjugués à la fluorescéine sont largement utilisés en cytométrie en flux et en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’immunophénotypage des sous-populations de leucocytes humains et la détection des antigènes de surface et intracellulaires à l’aide d’une excitation laser à 488 nm. En microscopie en immunofluorescence et en immunohistochimie, ces réactifs permettent la localisation des antigènes dans des coupes de tissus humains et des cellules en culture grâce à leur émission verte intense. D’autres applications comprennent les tests ELISA, le Western blot fluorescent, les essais de prolifération cellulaire utilisant le marquage à la CFSE et la détection de l’apoptose.
Cependant, la fluorescéine présente une sensibilité au pH, avec une fluorescence optimale entre pH 7,0 et 9,0, une diminution significative du signal en dessous de pH 7,0 et une sensibilité au photoblanchiment. Ces caractéristiques nécessitent l’utilisation de milieux de montage avec agents antifading, une réduction de l’exposition à la lumière ainsi que des protocoles de fixation appropriés. Les dilutions de travail sont généralement comprises entre 1:50 et 1:500 pour la cytométrie en flux, entre 1:100 et 1:1 000 pour l’immunofluorescence et entre 1:1 000 et 1:5 000 pour les tests ELISA.
Conserver à 4°C, à l’abri de la lumière ; ne pas congeler. Ces réactifs sont destinés exclusivement à la recherche et ne sont pas destinés aux procédures de diagnostic.