Les anticorps primaires anti-humains conjugués à la FITC (isothiocyanate de fluorescéine) et à la PE (R-phycoérythrine) sont respectivement des immunoréactifs fluorescents émettant dans le vert et l’orange, proposés sous forme de conjugués distincts pour la détection des antigènes humains dans les applications basées sur la fluorescence. Produits par immunisation d’espèces hôtes telles que la chèvre, le lapin, la souris ou le rat avec des immunoglobulines humaines purifiées ou des protéines humaines spécifiques, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués à l’un ou l’autre des fluorophores. La FITC (ex/em 495/519 nm) est un colorant de faible poids moléculaire compatible avec les lasers à 488 nm, offrant un bon rapport coût-efficacité et un rendement quantique élevé (~0,92). La PE (ex/em 488 ou 565/578 nm) est une phycobiliprotéine de 240 kDa présentant une intensité de fluorescence exceptionnelle (~25× supérieure à celle de la FITC), un coefficient d’extinction molaire élevé (1,96 × 106 M−1cm−1) et un rendement quantique élevé (~0,84), permettant la détection d’antigènes humains présents en faible abondance.
Les spécificités disponibles comprennent les anticorps anti-IgG humaine (H+L), anti-IgG humaine (Fc), les réactifs spécifiques d’isotypes (IgG1–IgG4, IgA, IgM) ainsi que les marqueurs CD humains (CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD45). Une adsorption croisée étendue est utilisée afin de réduire les liaisons non spécifiques. Les conjugués à la PE présentent une meilleure photostabilité, mais doivent être protégés de la lumière et ne doivent pas être congelés.
Applications
Les conjugués à la FITC et à la PE sont largement utilisés en cytométrie en flux et en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’immunophénotypage des sous-populations de leucocytes humains à l’aide d’une excitation laser à 488 nm. La PE est particulièrement adaptée à la détection de marqueurs présents en faible abondance en raison de son intensité de fluorescence supérieure. En microscopie en immunofluorescence, la FITC produit une émission verte, tandis que la PE génère une fluorescence orange intense. D’autres applications comprennent les tests ELISA, le criblage à haut contenu et l’immunohistochimie.
La FITC présente une sensibilité au pH et est sujette au photoblanchiment ; l’utilisation de milieux de montage avec agents antifading est donc recommandée pour la microscopie en fluorescence. La PE présente une sensibilité moindre aux variations de fluorescence liées au pH ainsi qu’une bonne photostabilité, bien qu’une protection contre la lumière reste importante lors de sa manipulation et de son stockage.