Les anticorps primaires anti-humains conjugués à l’APC sont des immunoréactifs fluorescents émettant dans le rouge lointain, optimisés pour la détection d’antigènes humains par cytométrie en flux avec excitation par un laser rouge. Produits après immunisation d’hôtes tels que la chèvre, le lapin ou la souris avec des immunoglobulines humaines purifiées ou des protéines humaines spécifiques, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués à l’allophycocyanine (APC), une phycobiliprotéine de 105 kDa dérivée de cyanobactéries, principalement de Spirulina platensis. L’APC présente des maxima d’excitation et d’émission d’environ 650/660 nm et est excitée de manière optimale par des lasers rouges (633–647 nm), couramment présents sur les cytomètres en flux modernes.
Avec un coefficient d’extinction molaire d’environ 7,0 × 105 M−1cm−1 et un rendement quantique de 0,68, l’APC présente une fluorescence particulièrement intense. Son émission dans le rouge lointain limite le chevauchement spectral avec le FITC (525 nm), la PE (578 nm) et la PerCP (675 nm), ce qui rend l’APC adaptée aux panels de cytométrie en flux multicolores. Les spécificités disponibles comprennent les anticorps anti-IgG humaine (H+L), anti-IgG humaine (Fc), ainsi que des réactifs spécifiques des isotypes ciblant les IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA et IgM. Des anticorps dirigés contre différents marqueurs CD humains, tels que CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25 et CD45, sont également disponibles. Une adsorption croisée étendue vis-à-vis des immunoglobulines de souris, de rat, de lapin et de bovin peut contribuer à réduire davantage les liaisons non spécifiques.
Applications
Les conjugués à l’APC sont largement utilisés en cytométrie en flux et en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’immunophénotypage des sous-populations leucocytaires humaines, notamment les lymphocytes T, les lymphocytes B, les cellules NK, les monocytes et les cellules dendritiques, dans le cadre de recherches en immunologie, hématologie et oncologie. L’excitation par un laser rouge permet leur intégration dans des panels multicolores avec des fluorophores tels que le FITC, la PE, la PerCP et le Pacific Blue™ pour une caractérisation approfondie du profil immunitaire.
En microscopie d’immunofluorescence et en immunohistochimie, l’APC peut être utilisée pour la localisation des antigènes grâce à la détection de sa fluorescence dans le rouge lointain, ce qui peut contribuer à réduire les interférences liées à l’autofluorescence des tissus. Les autres applications comprennent le criblage à haut contenu, les essais multiplex sur billes de type Luminex® pour le profilage des cytokines, les essais de prolifération cellulaire utilisant le marquage au CFSE et la détection de l’apoptose à l’aide de l’annexine V.
Manipulation et conservation
Pour la cytométrie en flux, les dilutions de travail typiques sont comprises entre 1:50 et 1:500, selon l’anticorps, l’antigène cible, le type cellulaire et les conditions expérimentales. Les anticorps conjugués à l’APC doivent généralement être conservés à 4 °C et protégés de la lumière. Ils ne doivent pas être congelés, sauf indication spécifique du fabricant. Ces réactifs sont destinés exclusivement à la recherche et ne sont pas destinés à des procédures diagnostiques.