Les anticorps primaires anti-humains conjugués à la FITC (isothiocyanate de fluorescéine) sont des immunoréactifs fluorescents émettant dans le vert, utilisés pour la détection des antigènes humains sur des plateformes standard basées sur la fluorescence. Produits par immunisation d'espèces hôtes telles que la chèvre, le lapin, la souris ou le rat avec des immunoglobulines humaines purifiées ou des protéines humaines spécifiques, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués à la FITC, un fluorophore de petite taille dont les maxima d'excitation et d'émission se situent respectivement à environ 495 et 519 nm. Le groupement isothiocyanate réagit avec les amines primaires des résidus de lysine, formant des liaisons thiourée stables. Les rapports fluorophore/protéine (F/P) sont généralement compris entre 3 et 8, permettant une intensité de fluorescence appropriée tout en préservant l'activité de liaison à l'antigène. La FITC présente un coefficient d'extinction molaire élevé (≈ 70 000 M⁻¹cm⁻¹) ainsi qu'un rendement quantique (≈ 0,92), contribuant à une intensité de fluorescence modérée. Cependant, la FITC est sensible au photoblanchiment et présente une fluorescence dépendante du pH, avec une émission optimale généralement observée entre pH 7,0 et 9,0 et une diminution significative du signal en dessous de pH 7,0. Les spécificités disponibles comprennent les anticorps anti-IgG humaine (H+L), anti-IgG humaine (Fc), les réactifs spécifiques d'isotypes (IgG1–IgG4, IgA, IgM, IgE), les marqueurs CD humains tels que CD3, CD4, CD8, CD14 et CD45, ainsi que des anticorps dirigés contre des cytokines. Une adsorption croisée étendue contre les protéines sériques d'origine murine, rat, lapine et bovine contribue à réduire les liaisons non spécifiques.

Applications

Les conjugués à la FITC sont largement utilisés en cytométrie en flux et en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l'immunophénotypage des sous-populations de leucocytes humains et la détection des antigènes de surface et intracellulaires à l'aide d'une excitation laser standard à 488 nm. En microscopie en immunofluorescence et en immunohistochimie, la FITC permet de visualiser et de localiser les antigènes dans des coupes de tissus humains et des cellules en culture grâce à sa fluorescence verte caractéristique. D'autres applications comprennent les tests ELISA, le Western blot fluorescent et les essais de prolifération cellulaire.

Compte tenu de la sensibilité de la FITC au photoblanchiment, l'utilisation de milieux de montage avec agents antifading ainsi que la réduction de l'exposition à la lumière d'excitation sont recommandées lors des analyses en fluorescence. Les dilutions de travail sont généralement comprises entre 1:50 et 1:500 pour la cytométrie en flux, entre 1:100 et 1:1 000 pour l'immunofluorescence et entre 1:1 000 et 1:5 000 pour les tests ELISA. Conserver à 4°C et à l'abri de la lumière ; ne pas congeler. Destinés exclusivement à la recherche.