Les anticorps primaires anti-cheval conjugués PE/Atto 594 sont des immunoréactifs à fluorophores en tandem conçus pour la détection par fluorescence à émission décalée vers les grandes longueurs d’onde dans les applications de cytométrie en flux multiparamétrique et d’imagerie. Produits par immunisation d’animaux hôtes tels que la chèvre, le lapin ou la souris avec des immunoglobulines de cheval purifiées, ces anticorps sont purifiés par chromatographie d’immunoaffinité puis conjugués à un complexe en tandem constitué de R-phycoérythrine (R-PE) et d’Atto 594. Ce conjugué en tandem repose sur le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) : la R-PE absorbe la lumière à 488 nm et transfère l’énergie au fluorophore accepteur Atto 594, qui émet ensuite à environ 617 nm. L’émission obtenue est ainsi nettement décalée vers le rouge par rapport à celle de la PE seule (578 nm), ce qui permet une meilleure séparation spectrale dans les panels multiparamétriques.

En tant que fluorophore accepteur, Atto 594 présente un rendement quantique élevé, une excellente photostabilité et une faible sensibilité au pH sur une large plage (pH 2–10). Le complexe en tandem conserve la forte luminosité de la R-PE (coefficient d’extinction molaire ≈ 1,96 × 10⁶ M⁻¹cm⁻¹) tout en produisant une émission dans la région orange-rouge, avec un chevauchement spectral limité avec le FITC (vert), la PE (orange) et l’APC (proche infrarouge). Une adsorption croisée approfondie contre les immunoglobulines de souris, de rat, de lapin et d’humain permet de réduire les liaisons non spécifiques. Ces conjugués doivent être conservés à 4 °C, à l’abri de la lumière, et ne doivent pas être congelés.

Applications

Les conjugués PE/Atto 594 sont principalement utilisés en cytométrie en flux et en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’immunophénotypage multiparamétrique des leucocytes équins. L’émission caractéristique à 617 nm est compatible avec les canaux de détection orange/rouge couramment utilisés et permet une détection simultanée avec le FITC (525 nm), la PE (578 nm), la PerCP (675 nm) et l’APC (660 nm) dans les panels multiparamétriques, bien qu’une compensation appropriée et une configuration spectrale adaptée à l’instrument doivent être établies expérimentalement. En microscopie d’immunofluorescence, la forte émission orange-rouge permet de localiser les antigènes dans les coupes tissulaires et les cellules en culture, avec une autofluorescence de fond généralement plus faible qu’aux longueurs d’onde plus courtes. Les autres applications comprennent le criblage à haut contenu, les immunodosages multiplex sur billes (par exemple, Luminex^®) et le Western blot fluorescent. Les dilutions de travail typiques sont comprises entre 1:50 et 1:500 pour la cytométrie en flux et entre 1:100 et 1:1 000 pour l’immunofluorescence. Ces réactifs sont exclusivement destinés à un usage en recherche (RUO – Research Use Only) et ne sont pas destinés aux procédures diagnostiques.