2. Différenciation du trophoblaste

La différenciation du trophoblaste est régulée par des programmes coordonnés de signalisation, de régulation transcriptionnelle et épigénétique qui contrôlent le maintien des progéniteurs cytotrophoblastiques (CTB) ainsi que leur engagement vers les états syncytiotrophoblastique (STB) et trophoblastique extravilleux (EVT). Ces mécanismes ont été étudiés à l'aide de systèmes complémentaires de cellules souches trophoblastiques humaines et murines, de modèles de différenciation de cellules souches pluripotentes humaines, de cultures primaires de trophoblastes, d'organoïdes et d'embryons murins génétiquement modifiés. Bien que plusieurs voies de régulation soient communes, la spécification et la différenciation des lignages trophoblastiques ne sont pas totalement conservées entre les espèces ; en particulier, le lignage EVT humain ne possède pas d'équivalent direct chez la souris.

Spécification transcriptionnelle et axe Hippo/TEAD4

Chez l'embryon murin, l'activité différentielle de la voie Hippo relie la position cellulaire et les contacts intercellulaires à la spécification du trophoblaste. La phosphorylation médiée par LATS restreint la localisation nucléaire de YAP dans les cellules internes, tandis qu'une diminution de l'activité de la voie Hippo permet l'interaction nucléaire de YAP avec TEAD4 dans les cellules externes. L'activité de TEAD4 est ainsi associée à la spécification du trophectoderme et à l'activation de programmes transcriptionnels caractéristiques du trophoblaste, notamment Cdx2. GATA3 agit au sein du réseau de régulation associé à TEAD4 et contribue, avec CDX2, à la spécification et à la différenciation du trophoblaste chez la souris. Le réseau transcriptionnel centré sur ELF5 constitue un niveau supplémentaire de régulation des cellules souches trophoblastiques. Les variations d'expression de ELF5 modifient ses interactions avec des régulateurs transcriptionnels, notamment EOMES et TFAP2C, influençant ainsi l'équilibre entre les programmes transcriptionnels associés à l'auto-renouvellement et ceux associés à la différenciation.

Dans les modèles de trophoblaste humain, les relations de régulation entre TEAD4, CDX2, GATA3 et les autres régulateurs de lignage sont plus complexes et ne doivent pas être considérées comme une reproduction directe de la hiérarchie observée chez la souris.

Signalisation BMP et engagement vers le lignage trophoblastique humain

BMP4 est largement utilisée, dans un contexte expérimental, pour induire une différenciation associée au trophoblaste à partir de cellules souches pluripotentes humaines. L'exposition à BMP4 active des programmes transcriptionnels caractéristiques du trophoblaste tout en réprimant les états associés à la pluripotence dans plusieurs systèmes expérimentaux. Les études portant sur la différenciation induite par BMP4 ont mis en évidence, dans certains modèles de cellules souches pluripotentes humaines, un intermédiaire de type cytotrophoblaste positif pour ΔNp63 avant la différenciation trophoblastique ultérieure. Un réseau transcriptionnel impliquant GATA2/3–TFAP2A/C a également été associé à l'acquisition et au maintien de l'identité trophoblastique, tandis que GATA3 contribue à l'engagement trophoblastique dans les systèmes de différenciation basés sur BMP4.

Les réponses induites par BMP4 sont fortement influencées par la modulation simultanée de voies de signalisation concurrentes. Les protocoles de différenciation de cellules souches pluripotentes humaines intègrent ainsi fréquemment l'inhibition des voies de signalisation Activine/Nodal/TGF-β et FGF afin d'orienter la différenciation vers des états associés au trophoblaste. Ces conditions demeurent expérimentales et dépendent du système utilisé ; elles ne doivent donc pas être interprétées comme une représentation universelle de la spécification ou de la différenciation physiologique du trophoblaste humain.

Signalisation Wnt/β-caténine et différenciation du trophoblaste

La voie canonique de signalisation Wnt/β-caténine participe à la régulation des cellules souches trophoblastiques et de leur différenciation, mais ses effets dépendent fortement de l'état cellulaire, du contexte développemental et des conditions expérimentales. La modulation expérimentale de la signalisation Wnt dans les modèles de trophoblaste humain peut modifier la prolifération, la différenciation, la migration, l'invasion et l'expression de gènes associés aux différents lignages. Ces observations soutiennent l'existence d'un rôle de la transcription dépendante de Wnt dans la différenciation trophoblastique et les phénotypes invasifs, sans pour autant démontrer que l'activation de Wnt constitue un déterminant unique ou universel de la spécification du lignage EVT.

La signalisation Wnt doit donc être considérée en association avec les autres mécanismes régulateurs des lignages contrôlant l'adhésion cellulaire, la migration, les interactions avec la matrice extracellulaire et l'état de différenciation du trophoblaste, plutôt que comme un moteur isolé du développement du trophoblaste extravilleux.

Signalisation Notch et TGF-β/SMAD

La signalisation Notch joue un rôle expérimentalement démontré dans le développement des lignages trophoblastiques humains. NOTCH1 est associé au développement du trophoblaste extravilleux (EVT), et la modulation expérimentale de la signalisation NOTCH1 modifie la différenciation vers le lignage extravilleux. NOTCH2 présente des profils d'expression distincts parmi les sous-populations de CTB du premier trimestre, ce qui est compatible avec une régulation dynamique de la signalisation de la famille Notch au sein des différentes populations trophoblastiques et de leurs états de différenciation. Toutefois, les différences d'expression ne doivent pas, à elles seules, être interprétées comme la preuve d'un rôle fonctionnel spécifique.

La signalisation TGF-β dépend également du sous-type trophoblastique et du stade de développement. Les analyses expérimentales de la phosphorylation, de la localisation et de l'expression de SMAD2/3 démontrent une activation différentielle de la voie canonique TGF-β selon les différentes populations trophoblastiques du premier trimestre. Ces observations soutiennent un rôle dépendant du contexte de la signalisation TGF-β/SMAD dans la différenciation trophoblastique, plutôt qu'un effet uniforme dans l'ensemble des populations trophoblastiques.

Signalisation Hypoxie/HIF et différenciation du trophoblaste extravilleux (EVT)

La disponibilité en oxygène constitue un régulateur environnemental de la différenciation trophoblastique pouvant être modulé expérimentalement. Une faible tension en oxygène peut orienter les CTB humains primaires vers un phénotype associé au trophoblaste extravilleux, cette réponse dépendant au moins en partie de la signalisation médiée par les facteurs inductibles par l'hypoxie (HIF). Les modifications induites par l'hypoxie comprennent des changements de morphologie cellulaire, d'adhésion et de programmes de différenciation, établissant ainsi un lien entre l'axe hypoxie/HIF/trophoblaste et l'acquisition de caractéristiques associées aux EVT. Ces observations indiquent que la signalisation dépendante de l'oxygène peut moduler la différenciation trophoblastique, même si la réponse précise demeure dépendante de la concentration en oxygène, du stade de développement et du modèle expérimental utilisé.

Culture des cellules souches trophoblastiques et différenciation dirigée

Les cellules souches trophoblastiques (TSC) humaines constituent un système expérimental permettant d'étudier l'auto-renouvellement du trophoblaste ainsi que sa différenciation en différents lignages. Les systèmes établis de culture de TSC humaines reposent sur l'activation de la signalisation du facteur de croissance épidermique (EGF), l'activation de la voie canonique Wnt, l'inhibition de voies favorisant la différenciation et l'utilisation d'un inhibiteur de ROCK au cours des étapes appropriées de culture. Dans le système de culture de TSC humaines actuellement établi, une modulation supplémentaire de l'état épigénétique, notamment par inhibition des histones désacétylases, contribue également au maintien de l'état de cellule souche trophoblastique.

La modulation expérimentale des voies de signalisation peut faire intervenir le CHIR99021 afin de stimuler la voie canonique Wnt, l'A83-01 ou des inhibiteurs apparentés pour inhiber la signalisation Activine/TGF-β, l'EGF pour soutenir la prolifération des cellules souches trophoblastiques, ainsi que le Y-27632 pour limiter le stress cellulaire dépendant de ROCK lors de certaines procédures expérimentales. Les systèmes de différenciation fondés sur BMP4 peuvent également utiliser des inhibiteurs tels que l'A83-01 et, dans certains contextes expérimentaux, le PD173074 afin de moduler les voies concurrentes TGF-β et FGF. Ces réactifs appartiennent à différents systèmes expérimentaux et ne doivent pas être interprétés comme constituant une formulation standardisée unique de différenciation trophoblastique.

L'augmentation expérimentale de l'AMPc intracellulaire par la forskoline est couramment utilisée pour favoriser la syncytialisation du trophoblaste ainsi que l'acquisition de caractéristiques associées au syncytiotrophoblaste (STB). Dans ces systèmes, la fusion cellulaire s'accompagne de modifications transcriptionnelles et morphologiques caractéristiques de la différenciation syncytiotrophoblastique.

Les cellules souches trophoblastiques murines constituent un modèle génétique complémentaire dans lequel des régulateurs tels que TEAD4, GATA3, ELF5, EOMES et TFAP2C peuvent être manipulés directement afin d'étudier le maintien des cellules souches trophoblastiques, la spécification des lignages et leur différenciation. Les résultats obtenus à partir de ce modèle demeurent essentiels pour définir les mécanismes transcriptionnels causaux, mais doivent être interprétés à la lumière des différences interspécifiques du développement trophoblastique.

Organoïdes trophoblastiques tridimensionnels

Les organoïdes trophoblastiques humains tridimensionnels constituent un modèle dans lequel les populations progénitrices de CTB peuvent être maintenues et différenciées au sein d'un environnement multicellulaire organisé. Les systèmes d'organoïdes trophoblastiques humains reproduisent plusieurs caractéristiques essentielles du développement précoce du trophoblaste placentaire et peuvent générer des populations trophoblastiques différenciées représentatives du syncytiotrophoblaste (STB) et, dans des conditions expérimentales appropriées, du trophoblaste extravilleux (EVT).

Les systèmes de culture d'organoïdes définis peuvent intégrer l'EGF, une modulation de la voie canonique Wnt, une inhibition de la voie TGF-β, ainsi que d'autres facteurs de croissance ou composants de la matrice extracellulaire afin de soutenir l'auto-renouvellement et la différenciation des cellules souches trophoblastiques. Des matrices extracellulaires apparentées assurent un support structural favorisant la formation tridimensionnelle des organoïdes et leur organisation épithéliale. Toutefois, la composition de la matrice et la disponibilité des facteurs de croissance peuvent influencer l'état cellulaire et la différenciation, faisant de la composition de la matrice extracellulaire une variable expérimentale importante.

Analyse unicellulaire et résolution des lignages

Le séquençage de l'ARN à l'échelle de la cellule unique (single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) permet une analyse à haute résolution de l'hétérogénéité trophoblastique, inaccessible aux approches transcriptomiques réalisées sur des échantillons en vrac (bulk RNA-seq). Les approches transcriptomiques unicellulaires et les méthodes d'inférence de trajectoires ont permis d'identifier des états trophoblastiques transcriptionnellement distincts et d'inférer les relations développementales entre les CTB progéniteurs, les CTB en cours de différenciation, les populations associées au STB et celles associées à l'EVT. Ces approches facilitent également la comparaison entre les tissus placentaires primaires et les modèles de cellules souches trophoblastiques ou d'organoïdes.

Les analyses d'inférence de trajectoire et de pseudotemps doivent néanmoins être interprétées comme des modèles computationnels des relations développementales plutôt que comme une démonstration expérimentale directe des transitions de lignage. Des approches complémentaires de traçage de lignage, de perturbation génétique, d'analyses fonctionnelles et d'études temporelles sont nécessaires pour établir des relations causales entre les différents états cellulaires.

Chez la souris, les manipulations génétiques de lignage ainsi que les approches de perte ou de gain de fonction fournissent des preuves complémentaires des relations causales entre l'activité des facteurs de transcription et le destin trophoblastique. La manipulation expérimentale de Tead4, Gata3 et Elf5, associée à des analyses de différenciation de cellules souches et d'embryons, a permis de distinguer les régulateurs indispensables à l'identité trophoblastique des facteurs secondairement associés à la différenciation.

Validation moléculaire et cellulaire

La validation de la différenciation trophoblastique repose généralement sur des analyses moléculaires, cellulaires et fonctionnelles concordantes. KRT7/CK7 est largement utilisé comme marqueur associé au trophoblaste, bien qu'il ne soit pas exclusivement spécifique de ce tissu. L'expression de CGB/hCG est fréquemment évaluée au cours de la différenciation du STB et reflète principalement les programmes endocriniens et de syncytialisation du trophoblaste plutôt qu'un marqueur définitif et indépendant de l'identité syncytiotrophoblastique. De même, HLA-G est couramment utilisé pour identifier les populations associées au trophoblaste extravilleux, en particulier les EVT différenciés et invasifs, mais son interprétation doit être associée à d'autres marqueurs de lignage ainsi qu'à des caractéristiques fonctionnelles.

L'immunofluorescence, l'immunohistochimie, la cytométrie en flux, la RT-PCR quantitative, le Western blot et le profilage transcriptomique constituent des approches complémentaires pour caractériser les phénotypes associés aux différents lignages trophoblastiques. Des analyses fonctionnelles permettent en outre d'évaluer la fusion cellulaire, la migration, l'invasion, l'adhésion et les interactions avec la matrice extracellulaire, offrant ainsi une interprétation intégrée des profils d'expression moléculaire et du phénotype cellulaire.

Pour le STB, la formation du syncytium et les modifications moléculaires associées à la fusion cellulaire constituent des critères particulièrement informatifs, tandis que les études portant sur l'EVT intègrent généralement des essais de migration et d'invasion associés à l'expression de HLA-G et d'autres marqueurs spécifiques de l'EVT. Ainsi, la combinaison d'analyses moléculaires, morphologiques et fonctionnelles est préférable à l'attribution d'une identité trophoblastique fondée sur un seul marqueur.

Vision intégrée de la différenciation trophoblastique

Dans leur ensemble, les études expérimentales soutiennent un modèle selon lequel les mécanismes de différenciation du trophoblaste résultent d'un réseau d'interactions entre les voies de signalisation Hippo/TEAD4, BMP, Wnt/β-caténine, Notch, TGF-β/SMAD et HIF, ainsi que des facteurs de transcription régulateurs de lignage, notamment CDX2, GATA3, TEAD4, TFAP2C et ELF5. La contribution relative de chacune de ces voies dépend de l'espèce, du stade du développement, de l'état cellulaire et du contexte expérimental. Leurs interactions contrôlent le maintien des cellules souches trophoblastiques, l'engagement des lignages, la fusion des syncytiotrophoblastes et l'invasion du trophoblaste extravilleux, tout en orchestrant les programmes cellulaires qui sous-tendent le développement précoce du placenta.