Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est une technologie puissante et à haut débit largement utilisée pour déterminer la séquence de l’ADN ou de l’ARN afin d’obtenir des informations sur la variation génétique, l’expression génique et la structure du génome. Le workflow NGS comprend plusieurs étapes distinctes, de l’extraction des acides nucléiques à l’analyse des données, permettant le séquençage parallèle massif de millions à des milliards de fragments d’ADN avec une grande rapidité et précision.
Extraction des acides nucléiques
La première étape consiste à isoler l’ADN ou l’ARN à partir de l’échantillon biologique. L’extraction d’acides nucléiques de haute qualité et en quantité suffisante est essentielle, et la pureté est généralement évaluée par spectrophotométrie (rapports A260/A280 autour de 1,8 pour l’ADN et 2,0 pour l’ARN). Les échantillons peuvent inclure des cultures cellulaires, des biopsies tissulaires, du sang ou d’autres sources. Les acides nucléiques extraits doivent être propres, intacts et exempts de contaminants pour garantir le succès des étapes ultérieures.
Préparation de la librairie
La préparation de la librairie est une étape cruciale qui transforme les acides nucléiques extraits en un format prêt pour le séquençage. Elle comprend plusieurs sous-étapes :
- Fragmentation : L’ADN ou l’ARN est fragmenté en morceaux plus petits d’une taille définie (généralement 100 à 300 paires de bases) à l’aide de cisaillement mécanique (sonication), de digestion enzymatique ou de méthodes chimiques.
- Réparation des extrémités et ajout d’une queue A : L’ADN fragmenté est réparé pour créer des extrémités franches, souvent avec l’ajout d’un nucléotide ‘A’ en overhang pour faciliter la ligature des adaptateurs.
- Ligature des adaptateurs : Des adaptateurs spécialisés avec des séquences spécifiques à la plateforme sont ligaturés aux extrémités des fragments. Ces adaptateurs permettent l’amplification, l’amorçage du séquençage et l’indexation des échantillons pour le multiplexage.
- Amplification (optionnelle) : L’amplification par PCR enrichit les fragments ligaturés aux adaptateurs afin de créer une quantité suffisante d’ADN de la librairie.
- Sélection de taille et purification : Les librairies sont purifiées et triées par taille pour exclure les fragments indésirables, garantissant des performances optimales de séquençage.
Les protocoles de préparation de librairie peuvent varier selon la plateforme de séquençage et l’application, mais suivent généralement ces principes de base.
Séquençage
Les librairies préparées sont chargées sur la plateforme de séquençage. Pour la technologie Illumina (la plateforme la plus courante), le séquençage est effectué par chimie de séquençage par synthèse, où des nucléotides marqués par des fluorophores réversibles sont incorporés dans le brin d’ADN. Une caméra enregistre les signaux fluorescents, chacun correspondant à une base spécifique, de manière massivement parallèle sur des millions de clusters sur la cellule de flux.
D’autres plateformes, telles qu’Oxford Nanopore, séquencent en mesurant les changements de courant électrique lorsque l’ADN simple brin passe à travers un nanopore, tandis que PacBio utilise la détection fluorescente en temps réel de l’incorporation des nucléotides. Le séquençage génère des millions à des milliards de lectures courtes ou longues selon la plateforme et l’application.
Analyse des données
Les données brutes issues du séquençage sont traitées via des pipelines bioinformatiques. Les étapes clés incluent :
- Contrôle de qualité pour filtrer les lectures de faible qualité
- Alignement ou assemblage des lectures contre un génome de référence ou assemblage de novo
- Appel de variants pour identifier mutations ou polymorphismes
- Analyse de l’expression pour le séquençage d’ARN
- Annotation fonctionnelle et interprétation pour tirer des conclusions biologiques
Des plateformes de données intégrées avancées permettent des analyses secondaires et tertiaires adaptées à la question de recherche ou clinique. Ce cadre de protocole NGS fournit une approche robuste pour l’analyse génétique à haut débit dans de nombreuses applications de recherche biologique et de diagnostic clinique. Chaque étape nécessite une optimisation minutieuse des réactifs, des échantillons et des conditions pour maximiser précision, couverture et reproductibilité.
