Le Western Blot est une technique largement utilisée pour détecter et quantifier des protéines spécifiques au sein d’un mélange complexe, qu’il s’agisse d’extraits de cellules ou de tissus, ou d’échantillons purifiés. Le processus implique plusieurs étapes clés qui doivent être soigneusement optimisées afin de garantir des résultats précis et reproductibles.
Protocole général de Western Blot
Sur la base de protocoles détaillés récents, le workflow principal comprend les étapes suivantes :
- Préparation des échantillons : Les lysats cellulaires ou tissulaires sont préparés à l’aide de tampons de lyse appropriés contenant des inhibiteurs de protéases afin d’éviter la dégradation des protéines. La concentration en protéines est mesurée (généralement par dosage BCA ou Bradford) afin de charger des quantités égales de protéines dans chaque puits.
- Électrophorèse sur gel : Les protéines sont dénaturées par ébullition dans un tampon de chargement contenant du SDS, qui leur confère une charge négative proportionnelle à leur taille. Elles sont ensuite séparées en fonction de leur poids moléculaire par SDS-PAGE sur des gels de polyacrylamide. Le pourcentage de gel dépend de la taille de la protéine cible, des pourcentages plus élevés étant utilisés pour les petites protéines.
- Transfert sur membrane : Les protéines sont transférées du gel vers une membrane telle que la nitrocellulose ou le PVDF. Cela implique la mise en place d’un « sandwich » de transfert et l’application d’un courant électrique dans un tampon de transfert pour faciliter la migration.
- Blocage : La membrane est incubée dans une solution de blocage afin de réduire les liaisons non spécifiques des anticorps.
- Incubation avec les anticorps : La membrane est incubée d’abord avec un anticorps primaire spécifique de la protéine cible, puis avec un anticorps secondaire conjugué à une enzyme telle que l’HRP. Les temps d’incubation et les dilutions dépendent de l’affinité de l’anticorps et des besoins en sensibilité.
- Détection : Des substrats chimiluminescents sont utilisés pour visualiser les bandes protéiques via film ou imagerie numérique. Alternativement, des anticorps marqués par fluorescence permettent une détection multiplexée à l’aide de systèmes d’imagerie compatibles.
- Analyse des données : L’intensité des bandes est quantifiée à l’aide de logiciels d’analyse d’images pour comparer les niveaux d’expression des protéines. Un bon blocage et des lavages appropriés réduisent le bruit de fond et les signaux non spécifiques.
