NeoTaqII Master mix
Description
- NeoTaq II Master Mix : mélange réactionnel prêt à l’emploi pour une PCR standard robuste et fiable.
- Contient une ADN polymérase, des dNTP, un tampon réactionnel et des additifs optimisés.
- Permet l’amplification de matrices d’ADN jusqu’à 6 kb.
- La concentration de MgCl2 de 2,5 mM permet la mise en œuvre d’une large gamme de protocoles de PCR.
- Les colorants de suivi bleu et jaune permettent un dépôt direct des produits sur les gels d’agarose.
- Absence d’activité exonucléase 3′→5′ ; produit des extrémités 3′ A-overhang adaptées au clonage TA.
- Pour les applications en aval fondées sur la fluorescence ou l’absorbance, il est recommandé de purifier au préalable les produits de PCR ou d’utiliser la version sans colorant.
Conditions de stockage
Ce mélange réactionnel doit être conservé entre -85 °C et -15 °C dans un congélateur sans cycles de décongélation afin de garantir une durée de conservation optimale. La stabilité thermique élevée du mélange enzymatique permet de le conserver à 4 °C ou même à température ambiante pendant une durée maximale de 4 semaines. Le produit reste stable jusqu’à la date d’expiration lorsqu’il est conservé dans les conditions spécifiées.
Contrôles qualité
Pureté
La pureté de la NeoTaq II DNA polymerase est >90 %, telle qu’évaluée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, suivie d’une coloration au bleu de Coomassie.
Contamination par l’ADN génomique
Le produit doit être exempt de toute contamination détectable par de l’ADN, telle qu’évaluée par PCR. Il est ainsi adapté à l’amplification d’ADN bactérien et fongique à l’aide d’essais PCR ciblant respectivement les gènes codant l’ARNr 16S et 18S.
Tests d’activité nucléasique
0,2 à 0,3 μg d’ADN plasmidique sont incubés avec le NeoTaq II Master Mix pendant 14 à 16 heures à 37 °C. Après incubation, l’ADN est visualisé sur un gel d’agarose coloré avec Safe DNA Gel Stain. Aucune entaille ni coupure visible de l’acide nucléique ne doit être observée.
Test fonctionnel
NeoTaq II Master Mix est testé pour évaluer ses performances lors d’une réaction de polymérisation en chaîne (PCR), avec amplification de fragments d’ADN de différentes tailles (1 et 2,5 kb) à partir d’ADN génomique humain. Les produits de PCR obtenus sont visualisés sous forme de bandes uniques sur un gel d’agarose coloré avec Safe DNA Gel Stain.
Résolution des problèmes
Absence d’amplification ou faible rendement
• Température d’hybridation inadéquate
La composition du mélange réactionnel peut influencer les propriétés de fusion des amorces et de l’ADN. Ajuster la température d’hybridation en fonction de l’amorce présentant la température de fusion (Tm) la plus faible, généralement de 5 °C à 10 °C en dessous de sa Tm.
• Présence d’inhibiteurs de la PCR
Certaines méthodes d’extraction de l’ADN, notamment celles utilisées pour l’isolement de l’ADN génomique, peuvent entraîner la co-purification d’inhibiteurs de la PCR. Réduire le volume d’ADN matrice ajouté à la réaction ou diluer l’ADN matrice avant son ajout à la réaction. Selon la concentration initiale en ADN, une dilution pouvant atteindre 1:10 000 peut s’avérer efficace pour améliorer les résultats.
• Concentration de Mg2+ trop faible
Le Mg2+ est présent dans le mélange réactionnel à une concentration finale de 2,5 mM, suffisante pour la plupart des cibles. Pour certaines cibles, une concentration plus élevée en Mg2+ peut être nécessaire. Effectuer une titration de 2,5 mM à 4 mM de concentration finale, par incréments de 0,5 mM. Remarque : le MgCl2 n’est pas fourni séparément.
Présence de bandes non spécifiques
• Hybridation non spécifique des amorces
Ajuster les conditions d’hybridation et/ou concevoir une nouvelle paire d’amorces, en augmentant leur longueur et en évitant les séquences complémentaires.