Les anticorps primaires anti-cheval conjugués au Pacific Blue™ sont des immunoréactifs fluorescents excitables dans le violet, conçus pour la détection à haute sensibilité en cytométrie en flux multicolore et en microscopie à fluorescence. Produits après immunisation d'hôtes tels que la chèvre ou le lapin avec des immunoglobulines de cheval purifiées, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués de manière covalente au Pacific Blue™, un fluorophore à petite molécule dérivé de la coumarine. Le Pacific Blue™ présente des maxima d'excitation et d'émission d'environ 401–410/452–455 nm et est excité de manière optimale par la raie laser violette à 405 nm, couramment disponible sur les cytomètres en flux modernes.
Le faible pKa phénolique du fluorophore (3,7) assure une fluorescence stable à pH physiologique (7,0–7,4), limitant ainsi les variations du signal dépendantes du pH dans les essais sur cellules vivantes. Avec un coefficient d'extinction molaire de 46 000 cm−1M−1 et un rendement quantique de 0,78–0,91, le Pacific Blue™ offre une luminosité modérée à élevée, adaptée à la détection d'antigènes équins faiblement abondants. L'émission bleue (environ 455 nm) présente un chevauchement spectral limité avec les fluorophores verts tels que le FITC et la PE, facilitant la conception de panels multicolores. Toutefois, le chevauchement spectral important avec le Brilliant Violet 421™ (BV421) empêche généralement leur utilisation conjointe en cytométrie en flux conventionnelle ; une résolution peut néanmoins être possible avec les plateformes de cytométrie spectrale utilisant des méthodes de déconvolution mathématique. Les spécificités disponibles comprennent les anticorps anti-IgG (H+L), anti-sous-classes d'IgG et anti-IgM.
Applications
Les conjugués au Pacific Blue™ sont principalement utilisés en cytométrie en flux et en tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l'immunophénotypage des leucocytes équins et la détection de marqueurs de surface cellulaire tels que CD4, CD8 et le CMH de classe II. L'excitation par laser violet permet une détection simultanée avec d'autres fluorophores dans des panels multicolores à haut niveau de multiplexage. En microscopie d'immunofluorescence et en immunohistochimie, la photostabilité du fluorophore permet l'acquisition d'images avec une photodégradation réduite. Les autres applications comprennent le criblage à haut contenu, le Western blot fluorescent et les essais multiplexés sur billes.
Les dilutions de travail typiques varient de 1:50 à 1:500 pour la cytométrie en flux. Les conjugués d'anticorps doivent être conservés à 4 °C, à l'abri de la lumière, et ne doivent pas être congelés. Ces réactifs sont destinés exclusivement à la recherche et ne sont pas destinés aux procédures diagnostiques.
