Les anticorps primaires anti-cheval conjugués à la HRP sont des immunoréactifs enzymatiquement marqués destinés à la détection colorimétrique, chimiluminescente et par chimiluminescence renforcée (ECL) des antigènes équins. Produits par immunisation d'animaux hôtes tels que la chèvre, le lapin ou la souris avec des immunoglobulines de cheval purifiées, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués de manière covalente à la peroxydase de raifort (HRP ; masse moléculaire ≈ 40 kDa), une glycoprotéine d'origine végétale dont les groupements prosthétiques à base d'hème sont essentiels à l'activité catalytique. La conjugaison est généralement réalisée par oxydation au periodate, qui oxyde les résidus glucidiques de l'enzyme en aldéhydes réagissant avec les amines primaires présentes sur l'anticorps, formant ainsi des liaisons stables de type base de Schiff. Le conjugué obtenu conserve un rapport molaire enzyme/protéine (E/P) d'environ 3–5, ce qui permet d'optimiser l'efficacité catalytique tout en préservant l'affinité de liaison à l'antigène. La HRP catalyse l'oxydation de différents substrats en présence de peroxyde d'hydrogène : le TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine) produit un composé coloré bleu mesurable à 450 nm ; le DAB (3,3'-diaminobenzidine) génère un précipité brun adapté à l'immunohistochimie ; et les substrats à base de luminol produisent une émission chimiluminescente détectable par film radiographique ou par des systèmes d'imagerie numérique. Les spécificités disponibles comprennent les réactifs anti-IgG (H+L), anti-IgG (Fc), anti-sous-classe d'IgG (IgG1, IgG2, IgG3) et anti-IgM. Les produits sont généralement fournis dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant des protéines stabilisantes telles que la BSA ou la gélatine, ainsi que 40–50 % de glycérol afin d'empêcher la congélation à –20°C. Une adsorption croisée étendue contre les immunoglobulines bovines, ovines, caprines, de lapin et de souris permet d'éliminer les liaisons non spécifiques dans les échantillons contenant plusieurs espèces.

Applications

Les conjugués à la HRP sont largement utilisés dans différents formats d'immuno-essais pour la détection d'antigènes équins. En Western blot, ces anticorps permettent une détection chimiluminescente sensible des protéines équines séparées par SDS-PAGE, avec des dilutions généralement comprises entre 1:1 000 et 1:50 000 selon l'abondance de l'antigène et la sensibilité du substrat. En ELISA, les conjugués à la HRP sont utilisés comme anticorps de détection pour quantifier les titres d'anticorps équins, les concentrations de cytokines ou les concentrations d'antigènes dans le sérum, le plasma et d'autres fluides biologiques ; les substrats chromogènes à base de TMB ou les substrats chimiluminescents permettent une détection sensible dans les formats direct et sandwich. En immunohistochimie et en immunocytimie, le dépôt de DAB ou d'AEC (3-amino-9-éthylcarbazole) médié par la HRP génère des précipités permanents au niveau des sites antigéniques dans les tissus fixés au formol et inclus en paraffine, les coupes congelées ou les cellules en culture, permettant une analyse morphologique en microscopie optique. Dans les applications de dot blot et de matrices protéiques, ces conjugués permettent une détection robuste pour le criblage simultané de multiples échantillons. D'autres applications comprennent les immuno-essais enzymatiques (EIA), les microarrays tissulaires et l'hybridation in situ.

Cependant, l'activité de la HRP est inhibée par l'azoture de sodium, couramment utilisé comme conservateur, ce qui nécessite l'utilisation de tampons exempts d'azoture pour obtenir des performances optimales. Les dilutions de travail typiques dépendent de l'application : 1:1 000–1:20 000 pour le Western blot (détection chimiluminescente), 1:1 000–1:100 000 pour l'ELISA et 1:200–1:5 000 pour l'immunohistochimie. Ces réactifs sont destinés exclusivement à la recherche et ne sont pas destinés aux procédures diagnostiques.