Les anticorps primaires anti-humains conjugués à la HRP sont des immunoréactifs marqués par une enzyme destinés à la détection chromogène, chimiluminescente et par chimiluminescence améliorée (ECL) des antigènes humains. Produits par immunisation d’espèces hôtes telles que la chèvre, le lapin, la souris ou le rat avec des immunoglobulines humaines purifiées ou des protéines humaines spécifiques, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués de manière covalente à la peroxydase de raifort (HRP ; PM ≈ 40 kDa), une glycoprotéine d’origine végétale contenant des groupements prosthétiques hémiques essentiels à son activité catalytique. La conjugaison est généralement réalisée par oxydation au périodate, au cours de laquelle les résidus glucidiques de l’enzyme sont oxydés en aldéhydes qui réagissent avec les amines primaires de l’anticorps, formant des liaisons de type base de Schiff stables. Le conjugué obtenu présente généralement un rapport molaire enzyme/protéine (E/P) d’environ 3–5, permettant d’optimiser l’efficacité catalytique tout en préservant l’affinité de liaison à l’antigène.
La HRP catalyse l’oxydation de différents substrats en présence de peroxyde d’hydrogène. Le TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine) produit un composé coloré bleu mesurable à 450 nm ; le DAB (3,3'-diaminobenzidine) génère un précipité brun adapté à l’immunohistochimie ; et les substrats à base de luminol produisent une émission chimiluminescente détectable à l’aide d’un film radiographique ou de systèmes d’imagerie numérique. Les spécificités disponibles comprennent les anticorps anti-IgG humaine (H+L), anti-IgG humaine (Fc), anti-IgG humaine (Fab), les réactifs spécifiques d’isotypes (IgG1–IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD), les marqueurs CD humains (CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD45), les cytokines (IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α) ainsi que les protéines de signalisation.
Une adsorption croisée étendue contre les protéines sériques d’origine murine, rat, lapine, caprine et bovine permet de réduire les liaisons non spécifiques dans les échantillons provenant de plusieurs espèces. L’activité de la HRP est inhibée par l’azide de sodium, couramment utilisé comme conservateur ; l’utilisation de tampons exempts d’azide est donc recommandée pour des performances enzymatiques optimales.
Applications
Western blot : les conjugués à la HRP permettent une détection chimiluminescente sensible des protéines humaines séparées par SDS-PAGE, avec des dilutions typiques comprises entre 1:1 000 et 1:50 000, selon l’abondance de l’antigène et la sensibilité du substrat.
ELISA : les conjugués à la HRP sont utilisés comme anticorps de détection pour la quantification des cytokines humaines, des anticorps, des hormones, des biomarqueurs de maladies et des marqueurs de maladies infectieuses, notamment le VIH, le VHB et le VHC, dans le sérum, le plasma et les surnageants de cultures cellulaires. Les substrats chromogènes à base de TMB ou les substrats chimiluminescents permettent une détection sensible dans les formats ELISA direct et ELISA sandwich.
Immunohistochimie et immunocytimie : le dépôt de DAB ou d’AEC (3-amino-9-éthylcarbazole) médié par la HRP produit des précipités permanents au niveau des sites antigéniques dans les tissus fixés au formol et inclus en paraffine, les coupes congelées ou les cellules humaines en culture, permettant une analyse morphologique par microscopie optique.
Dot blot et matrices protéiques : les anticorps conjugués à la HRP permettent une détection robuste pour le criblage simultané de plusieurs échantillons. D’autres applications comprennent les microarrays tissulaires, l’hybridation in situ et les immunodosages enzymatiques (EIA).