Les anticorps primaires anti-humains conjugués à la phosphatase alcaline (AP) sont des immunoréactifs marqués par une enzyme, destinés à la détection colorimétrique, chimiluminescente et fluorescente des antigènes humains dans les applications nécessitant une stabilité prolongée du signal et une compatibilité avec l’azoture. Produits après immunisation d’hôtes tels que la chèvre, le lapin ou la souris avec des immunoglobulines humaines purifiées ou des protéines humaines spécifiques, ces anticorps sont purifiés par affinité puis conjugués à la phosphatase alcaline, une métalloenzyme homodimérique de 140 kDa dérivée de l’intestin de veau ou de tissus bovins. L’AP contient des ions zinc et magnésium essentiels à son activité catalytique et présente une activité optimale à un pH compris entre 9,0 et 10,5. Contrairement à la peroxydase de raifort (HRP), l’AP n’est pas inhibée par l’azoture de sodium, ce qui permet son utilisation avec des tampons et des réactifs de conservation contenant de l’azoture. L’enzyme catalyse l’hydrolyse des esters de phosphate, permettant une détection avec différents substrats : le BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium) produit un précipité bleu-noir pour l’immunohistochimie ; le pNPP (p-nitrophényl phosphate) génère un produit soluble jaune, quantifiable à 405 nm en ELISA ; et le CDP-Star® (substrat chimiluminescent) produit une émission lumineuse durable pour le Western blot. Les conjugués à l’AP offrent une excellente stabilité, avec une génération continue du signal et sans effet d’épuisement du substrat, ce qui les rend adaptés aux incubations prolongées. Les spécificités disponibles comprennent les anticorps anti-IgG humaine (H+L), anti-IgG humaine (Fc), les réactifs spécifiques des isotypes (IgG1–IgG4, IgA, IgM, IgE), ainsi que les anticorps dirigés contre les marqueurs CD humains. Une adsorption croisée étendue permet d’éliminer les liaisons non spécifiques.

Applications

Les conjugués à l’AP sont utilisés dans différentes configurations d’immunoessais. En ELISA, le pNPP permet la quantification colorimétrique sensible de cytokines humaines, d’anticorps et de biomarqueurs de maladies, avec des plages de détection linéaires pouvant dépasser celles des systèmes chromogéniques à base de HRP. En Western blot, des substrats chimiluminescents tels que le CDP-Star® permettent de détecter des protéines humaines faiblement abondantes, avec une sensibilité pouvant atteindre le niveau du picogramme et une durée prolongée du signal, de plusieurs heures à plusieurs jours, facilitant ainsi les acquisitions répétées. En immunohistochimie et en hybridation in situ, le BCIP/NBT génère des signaux chromogéniques permanents permettant la localisation d’antigènes humains dans des coupes tissulaires et adaptés à l’archivage à long terme des lames. Les autres applications comprennent les microarrays tissulaires, les dot blots et les essais sur membranes. Les dilutions de travail typiques sont comprises entre 1:500 et 1:10 000. Ces réactifs sont destinés exclusivement à la recherche et ne sont pas destinés aux procédures diagnostiques.