Comme son nom l'indique, la RT-PCR en une seule étape combine la synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) du premier brin (la transcription inverse, RT) et la PCR subséquente dans un seul tube de réaction. Cette configuration de réaction simplifie le travail, réduit les variations et minimise les contaminations possibles. La RT-PCR en une seule étape permet de traiter plus facilement un grand nombre d'échantillons, ce qui permet d'effectuer des applications à haut débit. Cependant, la RT-PCR en une étape également ses désavantages. Elle utilise des amorces spécifiques de gène pour l'amplification, limitant l'analyse à quelques gènes par échantillon d'ARN. Comme la réaction est un compromis entre les conditions de transcription inverse et d'amplification, la RT-PCR en une seule étape pourrait être moins sensible et moins efficace dans certains cas. Cependant, l'utilisation d'une amorce spécifique du gène dans la RT-PCR peut aider à maximiser le rendement de l'ADNc cible et minimiser l'amplification.