Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) est une enzyme essentielle utilisée dans les applications de séquençage de nouvelle génération (NGS), en particulier lors de la préparation des librairies de séquençage. TdT est une ADN polymérase unique qui catalyse l’ajout de désoxynucléotides à l’extrémité 3′ hydroxyle des molécules d’ADN simple brin, de manière indépendante du brin matrice. Cette propriété permet l’ajout de queues homopolymériques ou de séquences nucléotidiques personnalisées sans nécessiter de matrice d’ADN.

Dans la préparation des librairies NGS, TdT joue un rôle crucial en ajoutant des queues homopolymériques – le plus souvent des queues polyadényliques (poly-A) – aux molécules d’ADN ou d’ADNc fragmentées. Ce marquage terminal facilite les étapes ultérieures d’amplification et de ligature des adaptateurs nécessaires au séquençage. Par exemple, les fragments d’ADN courts ou dégradés, dépourvus d’extrémités adaptées à la ligature ou à l’amplification, peuvent être efficacement modifiés par TdT afin de générer des extrémités 3′ uniformes et compatibles permettant l’hybridation d’amorces lors de l’amplification par PCR. Ce processus indépendant de la structure des extrémités d’ADN rend les approches basées sur TdT particulièrement polyvalentes pour divers types d’échantillons, y compris les échantillons difficiles tels que les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) ou l’ADN ancien.

Une méthode de NGS remarquable utilisant TdT est le Terminal Transfer Amplification and Sequencing (TTAS), qui repose sur deux cycles successifs de marquage terminal et d’amplification pour amplifier de très faibles quantités de fragments d’ADN courts sans recourir à des étapes de ligature traditionnelles. TdT ajoute une queue poly-A à l’extrémité 3′ de l’ADN, permettant l’hybridation et l’extension de l’ADN par des amorces oligo-T de manière linéaire. Cette méthode est particulièrement avantageuse pour l’ADN fragmenté ou chimiquement modifié, qui présente des difficultés pour les méthodes classiques de préparation de librairie. Le marquage par TdT facilite également la construction de librairies d’ADN de tailles variables et la sélection de séquences de polynucléotides selon leur affinité de liaison, en augmentant la complexité de longueur et en permettant une amplification PCR à l’aide d’amorces universelles.

Au-delà du marquage terminal, TdT est également utilisée pour le marquage des extrémités d’ADN avec des nucléotides fluorescents ou chimiquement modifiés, afin de permettre la fonctionnalisation avant le séquençage ou l’analyse. Ce marquage favorise la détection, le suivi ou l’augmentation de la résistance des fragments d’ADN à la dégradation par les nucléases dans les flux de travail du NGS.

Rôles clés de la Terminal Transferase dans le NGS

• Ajout indépendant du modèle de queues homopolymériques (par ex. poly-A) aux extrémités 3′ de l’ADN.
• Facilitation de l’amplification et de la ligature des adaptateurs pour l’ADN fragmenté ou dégradé.
• Mise en œuvre de méthodes de préparation de librairie sans ligature, telles que le TTAS.
• Fonctionnalisation des extrémités d’ADN avec des nucléotides fluorescents ou modifiés pour la détection.
• Grande polyvalence pour divers types d’échantillons, notamment les tissus FFPE et l’ADN ancien.

Mécanismes moléculaires et applications

• TdT ajoute des désoxynucléotides sans matrice d’ADN, prolongeant les extrémités 3′ pour créer des sites d’amorçage.
• Améliore l’amplification uniforme en générant des séquences terminales compatibles avec les amorces oligonucléotidiques.
• Utilisée dans des essais de création de librairies d’ADN de tailles variables pour l’étude des affinités de liaison.
• Employée pour la construction de librairies à haute efficacité et faible biais pour le séquençage de nouveaux échantillons complexes.