En immunohistochimie (IHC), lors de l’utilisation de systèmes de détection conjugués à la phosphatase alcaline (AP), il est important de traiter l’activité AP endogène qui peut provoquer un marquage de fond non spécifique, similaire à la peroxydase endogène dans les systèmes basés sur le HRP.
Pourquoi inhiber l’AP endogène ?
La phosphatase alcaline endogène est naturellement présente dans divers tissus tels que les reins, l’intestin, les ostéoblastes, les tissus lymphoïdes et le placenta. Elle est souvent plus prononcée dans les coupes de tissus congelés. Si elle n’est pas inhibée, l’AP endogène peut réagir avec des substrats AP comme le BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium), produisant un marquage de fond bleu/violet indésirable.
Méthodes pour inhiber l’AP endogène
- Ajout de lévamisole : La méthode la plus courante pour inhiber l’AP endogène consiste à inclure du lévamisole, un inhibiteur spécifique de l’AP, dans la solution de substrat. Le lévamisole, à une concentration d’environ 1 mM, inhibe sélectivement l’AP endogène sans affecter l’activité de la phosphatase alcaline conjuguée à l’anticorps de détection. De nombreux kits de chromogènes AP commerciaux incluent du lévamisole dans leurs mélanges de substrats.
- Récupération d’épitope par chaleur (HIER) : L’activité AP endogène peut également être réduite ou détruite par un traitement thermique lors de la récupération d’antigène (par exemple, ébullition dans des tampons citrate ou EDTA), qui dénature les enzymes endogènes.
Test de l’AP endogène
Avant le marquage, les tissus peuvent être testés pour l’activité AP endogène en incubant les coupes avec le substrat BCIP/NBT seul. Si un marquage bleu apparaît, un blocage est nécessaire.
Considérations sur les tampons
Éviter le PBS avec la détection AP : Contrairement aux protocoles HRP, la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est évitée lors du marquage AP car les ions phosphate inhibent l’activité de la phosphatase alcaline. À la place, la solution saline tamponnée au Tris (TBS) est recommandée pour le lavage et la dilution des réactifs.
Résumé des étapes de quenching AP
- Préparer les coupes de tissu (déparaffinisation, réhydratation, récupération d’antigène).
- Tester l’activité AP endogène si nécessaire.
- Inclure du lévamisole dans la solution de substrat AP pour inhiber l’AP endogène.
- Utiliser le TBS au lieu du PBS tout au long de la procédure de marquage.
- Poursuivre avec l’incubation de l’anticorps conjugué à l’AP et le développement du chromogène.